擴張床分離 吳慎劍

擴張床分離匯報人：吳慎劍

日期：2012.11.7擴張床吸附技術(shù)概述擴張床的吸附原理擴張床吸附基質(zhì)及裝置細胞及碎片對吸附劑性能的影響擴張床操作擴張床吸附存在的問題及前景一、概述它集過濾、濃縮和初步純化于一步完成，減少了操作步驟，縮短了操作時間，能提高收率和降低成本。發(fā)酵液或培養(yǎng)液的體積大、黏度高，故處理難、費時多，常使目標(biāo)蛋白質(zhì)受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被破壞。故第一步操作常常成為整個下游過程的制約步驟。擴張床吸附技術(shù)是一種集成化分離技術(shù)，即對已有的兩種單元操作進行有效的組合，組成一種更有效的單元操作，以達到提高產(chǎn)品收率，縮短純化步驟，降低純化費用和投資成本的目的。細胞懸浮液具有以下的特點目標(biāo)產(chǎn)物濃度普遍比較低；組分非常復(fù)雜，是含有細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類和無機鹽類等多種物質(zhì)的混合物；產(chǎn)物易失活，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被空氣氧化、易受微生物污染、易被蛋白酶水解二、擴張床的吸附原理發(fā)酵液內(nèi)含有大量的顆粒，這些顆粒要在進行層析前除去。目前除去固體顆粒最常用的方法是離心和過濾。離心和過濾工藝的缺點：1.步驟多，累積損失大；2.操作時間長，目標(biāo)產(chǎn)物易失活；3.對微米以下的顆粒，特別是對細胞碎片很難有效除去；4.投入高速離心機和超濾設(shè)備，增加了生產(chǎn)成本。離心、過濾：步驟多，累積損失大，操作時間長，目標(biāo)產(chǎn)物易失活，對微米以下的顆粒難除去，設(shè)備成本高。相當(dāng)于一個平衡級，效率差空隙小，易造成堵塞，床層壓降增大返混嚴(yán)重平推流，空隙率大，壓降小，吸附劑利用率高平推流是理想狀態(tài)下在流動方向上完全沒有返混，而在垂直于流動方向的平面上達到最大程度的混合。

上圖是全混釜、流化床、擴張床和固定床的操作模式的比較。其中全混釜上料液處于理想混合時，只相當(dāng)于一個平衡級，其效率比固定床差。一般液固相分離主要采取固定床方式，料液流經(jīng)裝有層析介質(zhì)的柱時在介質(zhì)層中流動基本上呈平推流，返混小，柱效高。但當(dāng)料液中含有固體顆粒時，由于介質(zhì)問的空隙很小，顆粒滯留在介質(zhì)間，造成堵塞，床層的壓降增大，最終使吸附無法進行，所以采用這種層析方法之前必須對原料液進行固液分離。幾個概念1.最低流化速度：料液自下向上運動，當(dāng)達到某一速度時，床層開始擴展，稱為最低流化速度2.終點沉降速度：床層繼續(xù)隨流速的增大而不斷擴張，吸附劑間隙增大，懸浮顆粒能通過，吸附劑仍能保持不被帶出的最大流速3.床層空隙率：擴張床高度與沉降高度之比。三、擴張床吸附基質(zhì)特性要求吸附劑的尺寸和密度應(yīng)保證其終端流速與料液中需除去的固形顆粒間有明顯的差異；吸附劑必須有一定的粒徑和密度分布，在擴張床中會形成穩(wěn)定的分級，從而減小固液相問的返混；吸附劑應(yīng)具有良好的孔道結(jié)構(gòu)，不易被料液中的脂類、核酸和雜蛋白等生物物質(zhì)污染；吸附劑應(yīng)具有特異性吸附的配基，使吸附劑對目標(biāo)產(chǎn)物具有較高的吸附容量；吸附劑應(yīng)具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的機械強度，其中較高的化學(xué)穩(wěn)定性可以保證吸附劑可以承受較苛刻的洗脫條件，而良好的機械強度可延長吸附劑的使用壽命；吸附劑應(yīng)具有良好的傳質(zhì)性能，在較高的流速下，可以保持較高的吸附量。商品化的擴張床/流化床介質(zhì)

介質(zhì)名稱直徑/um密度/(g/mL)表觀液體流速(cm/min)瓊脂糖-石英100-3001.153.0瓊脂糖-金屬80-1651.34.3瓊脂糖-不銹鋼20-403.72.5瓊脂糖-硅藻土200-4501.328.8瓊脂糖-玻璃100-3001.3-1.513.3葡聚糖-二氧化硅100-3001.358.0纖維素-二氧化鈦125-6001.210.8多孔玻璃130-2502.24.0(1)共混包埋法將增重微粒均勻分散在天然親水性高分子溶液中，通過溶解、結(jié)晶、再生等手段得到多孔基質(zhì)。瓊脂糖和纖維素都存在明顯的鏈聚集結(jié)晶區(qū)域，結(jié)晶再生時能形成穩(wěn)定的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并能將增重材料包埋其中。3.擴張床吸附基質(zhì)的制備

如將含纖維素的黃原膠溶液與含微米級TiO2顆粒的水溶液共混，升溫溶解，然后在甲醇溶液中再生，即得到混合型的基質(zhì)，但由于機械強度不夠，需要進行后交聯(lián)反應(yīng)增強基質(zhì)的強度。由于基質(zhì)是經(jīng)過研磨后篩分而得，形狀并不一致，這會影響擴張時的流體力學(xué)特性。另外，TiO2微粒隨機分散在纖維素骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，也會影響蛋白質(zhì)分子的傳質(zhì)效果。(2)反相懸浮聚合法采用反相懸浮聚合法將親水性的不銹鋼、二氧化鈦、二氧化鋯等增重內(nèi)核或微核包埋在親水性的天然高分子骨架中。例如使用石蠟油作分散相、Span85作乳化劑，將不銹鋼微珠分散在瓊脂糖的水溶液中，控制攪拌速度以獲得不同的瓊脂糖厚度，逐步降溫冷卻可獲得高密度核殼型基質(zhì)。如果在水相中加入交聯(lián)劑(如環(huán)氧氯丙烷)，則可實現(xiàn)反相懸浮交聯(lián)，基質(zhì)的強度進一步提高，而孔隙率并不受到明顯的影響。(3)懸浮聚合法將增重用的親水性不銹鋼、二氧化鈦等無機物進行表面改性處理，利用懸浮聚合將其包埋于高分子共聚物中。由于共聚的單體是有機親油性的，而增重劑都是無機親水性的，兩者相溶性較差，聚合過程中易發(fā)生相分離，對增重劑有機化表面改性的效果直接決定了能否較大地提高顆粒的密度。(4)表面改性法1.化學(xué)改性：通過化學(xué)反應(yīng)改變聚合物的物理、化學(xué)性質(zhì)的方法。2.共聚物改性4.擴張床吸附裝置基本結(jié)構(gòu)與固定床一樣上下分布器要求：分布器只能讓流體垂直向上流過；剪應(yīng)力控制在最小的范同內(nèi)，以防止產(chǎn)物變性；細胞或細胞碎片不易滯留；方便清洗。吸附柱設(shè)計要求：減小液相返混程度5.細胞及碎片對吸附劑性能的影響及評價研究表明，若細胞或細胞碎片等生物顆粒吸附在介質(zhì)上，將嚴(yán)重影響介質(zhì)對目標(biāo)物的吸附。下表列出了一些生物顆粒在不同吸附介質(zhì)表面的吸附情況，可見主要是靜電力在起作用。

在設(shè)計過程中，應(yīng)該考慮把生物顆粒的影響引入到擴張床的過程設(shè)計中，在過程開發(fā)的早起就同時兼顧“目標(biāo)物的吸附”和“生物顆粒順吸附劑互相作用”，及時發(fā)現(xiàn)并排除生物顆粒的負面影響，確保擴張床吸附過程的順利實施。生物顆粒Streamline擴張床吸附劑基質(zhì)苯基陰離子陽離子強化陰離子染料親和蛋白A親和面包酵母一一一十十一一十十一一面包酵母勻漿液一一一十一一十十一一大腸桿菌一一一一一十一一大腸桿菌勻漿液一一十一一十一一一一葡萄球菌一一一十一一十十一一雜交瘤細胞一一十十十十十十一一十十十

一一生物顆粒在不同吸附劑表面的吸附親和力種類：靜電引力；疏水性作用。危害：1.使吸附劑發(fā)生聚集

2.破壞擴張床的穩(wěn)定分級結(jié)構(gòu)

3.削弱分離效果

4.床層的崩潰評價方法：生物顆粒靜態(tài)吸附法、生物顆粒脈沖響應(yīng)法和停留時間分布(RTD)分析法。①生物顆粒靜態(tài)吸附法：②生物顆粒脈沖響應(yīng)法。③RTD分析法。擴散系數(shù)——表示氣體（或固體）擴散程度的物理量。擴散系數(shù)是指當(dāng)濃度為一個單位時,單位時間內(nèi)通過單位面積的氣體量。6.擴張床操作平衡(equilibration)、吸附(adsorption)、沖洗(washing)、洗脫(elution)在位清洗(cleaninplace)1)平衡擴張床在首次吸附操作前須用平衡緩沖液擴張，逐漸增大流速，讓擴張床擴張到一定程度，大約30min后達到平衡。擴張率過低，會造成料液中固體顆粒通過的困難；擴張率過高，會造成配基對目標(biāo)產(chǎn)物的吸附效率下降。擴張床的吸附操作中最適宜的擴張率為2~3。流速300cm·h-1時，用緩沖液擴張到固定床高度兩倍的擴張床吸附性能較好。擴張床內(nèi)吸附劑的填充高度在10cm以上，可以消除進口區(qū)域不均勻流化的影響，得到穩(wěn)定的床層和較低的返混程度。操作過程中，層析柱必須保持垂直，否則易發(fā)生不同層次之間的混合。2)吸附在吸附前，需先用平衡液將沉積的吸附劑流態(tài)化，建立一個穩(wěn)定的床層。然后，將平衡液切換成原料液，由于原料液的黏度、密度和固體顆粒含量與平衡緩沖液不同，若維持原來的操作條件不變，床的擴張率會增大。為了保持一定的擴張率，起先需降低流速以保持床高；而在吸附操作的后期，由于介質(zhì)吸附的蛋白質(zhì)、細胞、核酸等生物物質(zhì)，密度會有所增加，此時需要提高流速來維持原來的擴張率。在實際的吸附操作中，也可以采用維持流體流速，根據(jù)擴張高度的變化，調(diào)節(jié)擴張床內(nèi)的高度調(diào)節(jié)器。3)沖洗目的：除去床層間滯留的細胞和細胞碎片；除去非結(jié)合或弱結(jié)合性的可溶雜蛋白。除去顆粒雜質(zhì)沖洗時，流向與吸附時相同，采用的流體開始時大多使用平衡緩沖液。整個沖洗過程一般需要5～20倍沉降床體積的緩沖液。洗滌液的黏度或密度較低，會使床層不穩(wěn)定。用25％甘油溶液洗滌，效果較好，由于其黏度和密度較大，洗滌液呈活塞流，能有效地將細胞顆粒洗出而對床層的穩(wěn)定性無影響。流出液中觀測不到固體雜質(zhì)時可繼續(xù)保持?jǐn)U張床方式，也可改用固定床方式，因為采用擴張床流體速度限制在最小流化和夾帶速度之間，固定床的低速不受限制，此時緩沖液流向取決于操作方式。注意調(diào)節(jié)上部速率分布器的位置比床層上界面高出0.5～1.0cm。4)洗脫固定床方式洗脫是緩沖液從擴張床頂泵入，以固定床方式向下洗脫；優(yōu)點：減少洗脫緩沖液的用量，增加產(chǎn)物濃度，減少殘留在床內(nèi)的細胞對產(chǎn)物的污染，缺點：①洗脫時間比較長，洗脫操作復(fù)雜，需要調(diào)節(jié)高度調(diào)節(jié)器和反向進樣；②操作時膨脹介質(zhì)會產(chǎn)生聚集，影響其再度膨脹，造成在位清洗的困難；③床層壓降高，對介質(zhì)的機械強度要求高。擴張床方式洗脫是緩沖液從擴張床底部泵入，進行向上洗脫。優(yōu)點：①洗脫方式簡單，洗脫迅速；②可減少返壓；③不會造成吸附劑顆粒的聚集，提高清洗效率；④洗脫設(shè)備簡單；⑤可實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。5)清洗包括吸附劑的再生(Regeneration)和擴張床的消毒(Sanitization)。再生是維持吸附劑的吸附能力和確保所有雜質(zhì)都被清除的必要環(huán)節(jié)雜質(zhì)的危害：降低介質(zhì)的吸附容量，特別是反復(fù)使用的介質(zhì)，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致吸附劑的集聚，出現(xiàn)溝流，影響擴張床的混合特性小分子鏈霉素發(fā)酵液的不過濾直接用離子交換分離提取，其分離過程是鏈霉素發(fā)酵結(jié)束后僅先酸化后中和，而不過濾除去菌絲及固形物，直接從交換柱的下部，以表觀流速115～146cm·h叫送入柱中進行吸附，含菌絲及固形物的殘液從柱上部流}H，待穿透后切斷進料，用清水逆洗，將滯留的菌體和固形物等雜質(zhì)除凈，然后用稀硫酸洗脫并分段收集洗出液送去精制，離子交換柱則用酸和堿再生。擴張床過程將固液分離、吸附、濃縮集成在一起，大大簡化了操作步驟，并使鏈霉素的收率大幅度地提高6)擴張床吸附技術(shù)的應(yīng)用

擴張床吸附技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包涵體、胞內(nèi)、圍膜、胞外分泌；酵母菌、動物細胞、雜交瘤、昆蟲細胞等表達的重組生物產(chǎn)品的純化，亦被應(yīng)用于動植物組織、果汁、動物乳汁以及其它一些微生物