土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)上課用

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌(計數(shù))一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照

1、實例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反應(yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株總之：要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；配置合適的培養(yǎng)基方法：⑴抑制大多數(shù)微生物生長⑵造成有利于該菌生長的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過稀釋涂布平板法等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養(yǎng)基尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源，才能生長。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5、該培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離能分解尿素的細菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長能分解尿素的細菌生長多種微生物是欄目鏈接用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是()A．未接種的選擇培養(yǎng)基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D．接種了的選擇培養(yǎng)基C1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算教材P22實例分析P22

第一同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個平板，但是其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。注意事項①為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。(即設(shè)置重復(fù)組求平均數(shù))③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。微生物的計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)、間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）、比濁法、濾膜法設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：設(shè)置對照的方法：①空白對照：不給對照組任何處理因素。②條件對照（標準對照）：指給予對照組一種被證明有效因素的處理③自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進行。④相互對照：不單設(shè)對照組，而是幾個實驗組相互對照。課P23實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因:(1)培養(yǎng)基被雜菌污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))

(2)土壤不同小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案二：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案一：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。將細菌放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，它會繁殖并形成菌落(如下圖)。某實驗小組想檢驗兩種抗生素的殺菌作用，下列哪個實驗方案最合適(

)C④菌落計數(shù)②系列稀釋③涂布平板與培養(yǎng)①配制土壤溶液根據(jù)圖示2－7填寫以下實驗流程：實驗設(shè)計：（一）土壤取樣（二）制備培養(yǎng)基（三）土壤樣品的稀釋（四）取樣涂布（五）微生物的培養(yǎng)與觀察（八）鑒定（七）細菌的計數(shù)二.實驗的操作流程

選擇培養(yǎng)基（尿素培養(yǎng)基）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(作對照)二.實驗的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作對照）◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度[三]土壤樣品的稀釋◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細菌104、105、106保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。

為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。（四）取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個或2個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基（作重復(fù)組），1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作對照）㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。微生物的培養(yǎng)與觀察同種微生物有穩(wěn)定的菌落特征：形狀，大小，隆起程度，顏色（六）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學(xué)藥品，不影響微生物的生存1、酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅→脲酶陽性2、伊紅—美藍培養(yǎng)基：鑒定大腸桿菌原理：代謝產(chǎn)物與伊紅—美藍結(jié)合→菌落呈黑色并帶有金屬光澤。CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O屬鑒別培養(yǎng)基，它并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長

伊紅—美藍培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，因為的代謝產(chǎn)物與伊紅—美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

三、操作提示

無菌操作

做好標記

規(guī)劃時間

（一）①培養(yǎng)物(即培養(yǎng)的目的菌種)中是否有雜菌污染?②以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落?

①對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。四.結(jié)果分析與評價如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠，需要進一步分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作是否成功

如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。

（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致操作實驗組對照組判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用選擇培養(yǎng)基接種選擇培養(yǎng)基不接種選擇培養(yǎng)基接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種需將未接種的選擇培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)需設(shè)立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數(shù)目、進行對比得出結(jié)實驗設(shè)計原則(1)設(shè)立重復(fù)組：統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時，要至少涂布三個平板作重復(fù)組，增強實驗結(jié)果的說服力與準確性。(2)設(shè)立兩種對照組：欄目鏈接四.結(jié)果分析與評價22本課題知識小結(jié):課后練習(xí)2.提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。

由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養(yǎng)基外，還應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進行實驗設(shè)計。11．某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難以降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到了能高效降解化合物A的細菌(“目的菌”)。請分析回答下列問題。(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選__________，這種培養(yǎng)基屬于__________培養(yǎng)基。(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養(yǎng)基中的__________，實驗需要振蕩培養(yǎng)，由此推測“目的菌”的代謝類型是__________。(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量____________的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量__________。(4)可采用__________的方法將“目的菌”接種到固體培養(yǎng)基上，通過__________法對“目的菌”的數(shù)量進行統(tǒng)計，通常需要對菌落數(shù)為__________的平板進行計數(shù)。(5)實驗結(jié)束時，使用過的培養(yǎng)基應(yīng)該進行__________處理后，才能倒掉。“目的菌”選擇化合物A異養(yǎng)需氧型減少增加稀釋涂布平板活菌計數(shù)30～300滅菌

1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()

A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓(xùn)練CD3.下列說法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物