相應(yīng)面法提取工藝分析

響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取夏枯草總黃酮的工藝研究

開題報(bào)告人：王玲燕指導(dǎo)老師：葛立軍班級(jí)：藥學(xué)專升本（2）班目錄一二三六

五四選題依據(jù)和目標(biāo)研究技術(shù)路線研究方案課題關(guān)鍵及難點(diǎn)完成該課題已具備的條件參考文獻(xiàn)

七研究進(jìn)度安排一.選題依據(jù)和目標(biāo)

背景：夏枯草PrunellavulgarisL，別名：麥穗夏枯草、鐵線夏枯草等。唇形科，夏枯草屬。多年生草本植物,廣泛分布于我國河南、安徽、江蘇等省。夏枯草含有蕓香苷、金絲桃苷等黃酮類成分。具有清肝明目、活血化瘀及抗癌、抗氧化等作用。研究?jī)?nèi)容：本課題以夏枯草黃酮為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面優(yōu)化酶法，以夏枯草黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析(RSM)，得出夏枯草黃酮提取的最佳工藝條件。意義：酶法提取夏枯草黃酮的工藝較好,所得的黃酮得率較高,為以后的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。夏枯草單因素試驗(yàn)溫度PH酶解時(shí)間Box-Behnken的中心組合原理工藝流程酶處理粗提物工藝條件加酶量響應(yīng)面試驗(yàn)Design-Expert軟件三.課題關(guān)鍵問題及難點(diǎn)1.關(guān)鍵問題纖維素酶解是本課題的關(guān)鍵用纖維素酶使其細(xì)胞壁破裂，并使其黃酮類成分溶出完全，提高黃酮得率。因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍裕饔脳l件較溫和等特點(diǎn)。2.難點(diǎn)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化是本課題的難點(diǎn)。首先必須通過大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立一個(gè)合適的數(shù)學(xué)模型，然后再用此數(shù)學(xué)模型作圖，如何獲取誤差范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。四、研究已具備的條件1.前期籌備了大量研究所需資料，及查閱了豐富相關(guān)的文獻(xiàn)。2.

掌握了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技能。3.所需儀器，包括離心機(jī)、搖床、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴箱、電子天平等。4.蘆丁、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、硫酸亞鐵、纖維素酶

5.經(jīng)費(fèi)充足研究工作基礎(chǔ)所需儀器和設(shè)備所需試劑經(jīng)費(fèi)情況五、研究方案5.1最大吸收波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解后，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。在紫外分光光度計(jì)200-800nm處進(jìn)行波長掃描，測(cè)定最大吸收波長。精密稱取蘆丁對(duì)照品1mg置50mL容量瓶中，加適量乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻備用。量取對(duì)照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分別置10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。采用分光光度法，在最大吸收波長處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.最大吸收波長的選擇2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備五、研究方案5.2總黃酮提取方法和其含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取5.00g夏枯草，用纖維素酶預(yù)處理，酶解后滅活，并離心。然后加入一定體積某濃度的乙醇，在一定溫度下加熱回流一定的時(shí)間，過濾。棄去濾渣，測(cè)量并記錄濾液體積V，得到夏枯草總黃酮的乙醇溶液，即待測(cè)液。取0.5mL待測(cè)液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL振蕩搖勻，放置6min后加入10%硝酸鋁溶液0.3mL振蕩搖勻，放置6min后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，用分光光度法在510nm測(cè)定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總黃酮含量?？傸S酮提取總黃酮含量五、研究方案（1）酶的種類對(duì)夏枯草黃酮得率的影響（2）加酶量對(duì)夏枯草黃酮得率的影響（3）

pH值對(duì)夏枯草黃酮得率的影響（4）酶解溫度對(duì)夏枯草黃酮得率的影響（5）酶解時(shí)間對(duì)夏枯草黃酮得率的影響5.3單因素試驗(yàn)表6-1酶的種類對(duì)黃酮提取率的影響酶的種類纖維素酶果膠酶蛋白酶空白對(duì)照(醇提)黃酮得率(%)表6-2加酶量對(duì)黃酮提取率的影響加酶量U/ml1234黃酮得率(%)表6-3PH對(duì)黃酮提取率的影響PH3.54.04.555.5黃酮得率(%)表6-4酶解溫度對(duì)黃酮提取率的影響酶解溫度(℃)4045505560黃酮得率(%)表6-5酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響酶解時(shí)間11.522.53黃酮得率(%)五、研究方案5.4響應(yīng)面試驗(yàn)系統(tǒng)考察酶解法的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實(shí)際情況，選用加酶量（X1），酶解溫度（X2），pH（X3），酶解時(shí)間（X4），作為考察因素，具體參數(shù)詳見因素水平表（表1），以測(cè)得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表（表3）提取，得到相應(yīng)供試液。表6-6因素水平水平因素X1加酶量(U/ml)X2酶解溫度(℃)X3pHX4酶解時(shí)間(h)-114541.502504.52135552.5表6-7響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表試驗(yàn)X1加酶量(U/ml)X2酶解溫度(℃)X3pHX4酶解時(shí)間(h)黃酮得率(%)1-1-1002-110031-10041100500-1-1600-117001-1800119-100-110-100111100-1121001130-1-10140-1101501-1016011017-10-1018-10101910-10201010210-10-1220-10123010-12401012500002600002700002014.12—2015.04查找資料，文獻(xiàn)綜述2015.04—2015.05開題報(bào)告，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2015.05—2015.09完成實(shí)驗(yàn)，整理數(shù)據(jù)2015.09—2015.11撰寫論文，論文答辯六.研究進(jìn)度安排

1.王蘭,趙麟.響應(yīng)面分析法優(yōu)化柿葉總黃酮提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2011(03).2.于敬,周晶.生物酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25(5):340-344.3.薛明，馮怡，徐德生．夏枯草化學(xué)成分及藥理作用的研究概況[J]．江蘇中藥，2005，26(5)：55--56．4.