第10章 合子胚培養(yǎng) - 副本

第10章合子胚培養(yǎng)1合子胚培養(yǎng)的概念1.1植物胚胎培養(yǎng)的概念植物胚胎培養(yǎng)是指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。

1.2合子胚培養(yǎng)的概念合子胚培養(yǎng)是指在無菌條件下分離和培養(yǎng)有性胚，以期獲得可育植株的一種技術(shù)。1904年，Hannig最早在無菌條件下進(jìn)行了離體胚培養(yǎng)實驗（辣根菜和胡蘿卜的成熟胚）。依靠合子胚培養(yǎng)技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)能夠挽救早熟敗育的雜種胚。

2胚培養(yǎng)的類型2.1成熟胚培養(yǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基只需含無機(jī)鹽和糖即可；提供合適的生長條件及打破休眠。培養(yǎng)技術(shù)：成熟胚培養(yǎng)技術(shù)也要求不嚴(yán)操作：受精后的果實或種子（帶種皮）表面消毒剝離種胚培養(yǎng)完整植株。發(fā)育途徑：主要是直接形成幼苗2.2幼胚（未成熟胚）培養(yǎng)幼胚指的是尚未成熟即發(fā)育早期的胚。特點：培養(yǎng)困難，對培養(yǎng)基的要求復(fù)雜對培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)條件的要求較高幼胚培養(yǎng)發(fā)育途徑：（1）繼續(xù)正常的胚胎發(fā)育過程，維持胚性生長，最終形成具有萌發(fā)能力的成熟胚。進(jìn)行幼胚培養(yǎng)時，關(guān)鍵是維持胚性生長（此途徑為需要途徑）。為了保證離體幼胚能沿著胚胎發(fā)生的途徑發(fā)育，其對營養(yǎng)的需求較成熟胚復(fù)雜。（2）不能維持胚性生長，迅速萌發(fā)為幼苗。幼胚未經(jīng)完成正常的胚胎發(fā)育過程而形成幼苗的現(xiàn)象稱為“早熟萌發(fā)”(precociousgermination，不需要)。（3）形成愈傷組織。若形成愈傷組織，愈傷組織可再分化形成植株。3合子胚培養(yǎng)的技術(shù)措施3.1材料的選擇與滅菌（p157）（1）幼胚培養(yǎng)

選材：因植物類型及實驗?zāi)康牡牟煌煌砻嫦荆簩κ芫笞臃窟M(jìn)行表面消毒（2）成熟胚培養(yǎng)：取成熟的果實或種子進(jìn)行表面消毒，再分離胚進(jìn)行和培養(yǎng)。3.2胚的分離及培養(yǎng)3.2.1胚的分離成熟胚的剝離：較容易幼胚的剝離（p157～158）：表面消毒切開子房壁取出胚珠剝離珠被取出完整幼胚培養(yǎng)3.2.2胚的培養(yǎng)成熟胚的培養(yǎng)：只需提供合適的生長條件及打破休眠，即可在比較簡單的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長，形成幼苗。故培養(yǎng)基只需含無機(jī)鹽和糖即可。另外，成熟胚培養(yǎng)技術(shù)也要求不嚴(yán)。未成熟胚的培養(yǎng)：要求的技術(shù)和條件較高。胚胎發(fā)育過程可分為兩個時期：異養(yǎng)期和自養(yǎng)期。胚由異養(yǎng)轉(zhuǎn)入自養(yǎng)是其發(fā)育的關(guān)鍵時期。在這兩個時期之內(nèi)，培養(yǎng)中的胚對外源營養(yǎng)的要求隨胚齡的增加而逐漸趨向簡單（p153，表9.1）。在人工培養(yǎng)基上幼胚培養(yǎng)難成功，利用胚乳看護(hù)培養(yǎng)（為什么？），可顯著提高幼胚的成活率?？捎猛N胚乳，也可用異種胚乳（p159）。4影響胚培養(yǎng)的因素4.1培養(yǎng)基4.1.1無機(jī)鹽用于胚培養(yǎng)的無機(jī)鹽配方很多，對其中每種成分的作用并無精確的評價。

成熟胚培養(yǎng)中，主要采用一些較簡單的培養(yǎng)基，如Tukey、Randolph、White等。幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。根據(jù)Monnier(1976)的研究，在一定的培養(yǎng)基上，未成熟胚的生長和存活之間并不存在相關(guān)性（p161，圖9.4），并設(shè)計了新的培養(yǎng)基（p154～155，表9.3）。另據(jù)Umbeck和Norstog(1979)報道，培養(yǎng)基中的NH4＋對于大麥未成熟胚的正常生長和分化是必需的。4.1.2碳水化合物和培養(yǎng)基的滲透壓種類：蔗糖最好濃度：因胚的發(fā)育時期而有所不同。成熟胚在含2％蔗糖的培養(yǎng)基中就能很好生長；幼胚則要求較高水平的糖濃度（一般為8％～12％），如果濃度過低，會引起幼胚過早萌發(fā)。在長期的培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加，必須把胚轉(zhuǎn)移到蔗糖水平逐步降低的培養(yǎng)基中。蔗糖不僅是作為一種能源，而且是為了保持適當(dāng)?shù)臐B透壓，后者對于未成熟胚的培養(yǎng)來說尤為重要。

另有觀點認(rèn)為，胚在離體條件下的生長和分化在很大程度上并不依賴于滲透壓的大小，而主要取決于某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在與否。4.1.3氨基酸和維生素在胚培養(yǎng)中加入氨基酸，無論是單一的還是復(fù)合的，都能刺激胚的生長。加單一氨基酸時，以谷氨酰胺最有效。水解酪蛋白(CH)是一種氨基酸復(fù)合物，一直被廣泛用于胚培養(yǎng)。胚對水解酪蛋白的敏感性因物種而異。常用于胚培養(yǎng)的維生素類有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。維生素對發(fā)育初期的幼胚培養(yǎng)是必需的，但對已萌發(fā)生長的胚，可能對其形態(tài)發(fā)生有抑制作用。

4.1.4植物生長調(diào)節(jié)劑除了在某些植物中為了打破休眠以外，沒有證據(jù)表明離體的成熟或未成熟胚的正常發(fā)育需要外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。實際上，生長素對于胚的生長通常表現(xiàn)抑制作用。如果為了由胚和胚段誘導(dǎo)愈傷組織，則通常都須在培養(yǎng)基中加入生長素或細(xì)胞分裂素，或二者都加。4.1.5天然有機(jī)物正常植物體上，胚的生長受胚乳滋養(yǎng)，因此，加入一些天然的胚乳或種子提取物，對離體胚的生長有促進(jìn)作用。某一植物的胚乳組織提取物對該植物胚的生長較好。

其它如椰子汁、番茄汁等有較好效果。4.1.6培養(yǎng)基的pH培養(yǎng)基的pH對胚的培養(yǎng)也有一定的影響。例子：如薺菜離體胚在pH值為5.4～7.5的培養(yǎng)基中都能正常生長。對紫花曼陀羅心形早期的胚培養(yǎng)最適pH值在5.0～7.5的范圍內(nèi)。8日齡的水稻胚在pH值5和9時，生長最好。Norstog和Smith(1963)報道，培養(yǎng)基的pH值對于大麥未成熟胚的器官分化是關(guān)鍵因素，最適值約為4.9。4.2培養(yǎng)條件4.2.1溫度大多數(shù)植物胚培養(yǎng)的溫度為25～30℃，但也有些植物需要較低或較高的溫度。如：馬鈴薯：20℃；香子蘭(Vanillafragrans)：32～34℃；柑橘、蘋果、梨：25～30℃；棉花：32℃；桃：胚培養(yǎng)需在變溫條件下進(jìn)行4.2.2光照由于胚在胚珠內(nèi)的發(fā)育是不見光的，所以一般認(rèn)為在黑暗或弱光下培養(yǎng)幼胚比較適宜，光對胚胎發(fā)育有輕微的抑制作用。離體培養(yǎng)條件下進(jìn)一步發(fā)育的幼胚對光的需求，因植物種類而異。4.3胚柄胚柄的形態(tài)結(jié)構(gòu)：p158，圖9.1有關(guān)胚柄的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞學(xué)和生理生化的詳細(xì)研究表明，胚柄積極參與幼胚的發(fā)育過程。有研究指出在幼胚培養(yǎng)中，胚柄的存在對幼胚的存活是關(guān)鍵。使用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如5mg／L赤霉素能有效地取代胚柄的作用。當(dāng)沒有胚柄存在時，一定濃度范圍的KT可促進(jìn)幼胚的生長，但其作用難與赤霉素相比。但Monnier(1978)的觀點是，無胚柄的極幼齡胚所以難于培養(yǎng)，是由于在除掉胚柄時所引起的損傷造成的。5胚培養(yǎng)的應(yīng)用5.1通過“胚拯救”獲得遠(yuǎn)緣雜種通過“胚拯救”即可克服這種受精后障礙，產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種?！芭哒取钡姆绞接腥N：5.1.1雜種幼胚在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)在發(fā)生“受精后障礙”的情況下，若把雜種胚在開始夭折之前剝離出來，置于一種適當(dāng)?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，則雜種胚常常表現(xiàn)出正常生長的潛力，最終長成雜種植株（p172）。例子：草木犀、百合、車軸草屬、稻屬植物、番茄等如果胚的夭折發(fā)生在發(fā)育的極早期，由于人工培養(yǎng)基很難取代天然胚乳的作用，采用以上方法拯救雜種仍會遇到很大困難，在這種情況下，則可嘗試胚乳看護(hù)培養(yǎng)法（p172～173）。5.1.2雜種幼胚的胚乳看護(hù)培養(yǎng)在以上兩種方法皆難奏效的情況下，則可嘗試雜種幼胚愈傷組織培養(yǎng)法，即先把雜種幼胚誘導(dǎo)成愈傷組織，經(jīng)過或長或短的繼代培養(yǎng)之后，再誘導(dǎo)雜種愈傷組織分化植株（p173）。5.1.3雜種幼胚的愈傷組織培養(yǎng)步驟：有性雜交雜種幼胚培養(yǎng)雜種愈傷組織形成愈傷組織增殖莖芽分化植株再生例子：小麥×簇毛麥、大麥×小麥、栽培番茄×智利番茄等5.2獲得單倍體在遠(yuǎn)緣雜交之后，通過染色體的定向消除而產(chǎn)生單倍體，是胚培養(yǎng)的另一項新用途（p175）。例子：栽培大麥×球莖大麥5.3打破種子休眠，縮短育種周期許多植物的種子發(fā)育不完全或有抑制物存在而影響種胚發(fā)芽。而通過幼胚培養(yǎng)，可促使這些植物的幼胚達(dá)到生理和形態(tài)上的成熟而提早萌發(fā)，形成植株。

在有些情況下，園藝植物如落葉樹的育種工作，會因種子休眠期太長而延誤。通過胚的離體培養(yǎng)，可使休眠期縮短（p176）。

5.4提高種子萌發(fā)率，繁殖稀有物種長期營養(yǎng)繁殖的植物具有形成種子的能力，但其生活力較