第4章 細胞培養(yǎng)的基本技術

第4章細胞培養(yǎng)的基本

技術教學目的1、掌握細胞培養(yǎng)操作基本要領和要求2、了解細胞培養(yǎng)常用的基本方法和操作要領無菌技術貫穿細胞培養(yǎng)的始終一、基本操作技術和要求一、培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作第一節(jié)細胞培養(yǎng)操作基本要領和要求(一)培養(yǎng)前的準備有條不紊和安全可靠1.培養(yǎng)用物品的滅菌消毒(寫出物品的清單)2.操作臺的消毒(各種物品布局合理進行紫外線消毒30分鐘;3.洗手和著裝(原則上與外科手術相同)4.火焰消毒(酒精燈使用、金屬器械、吸過培養(yǎng)液的吸管).（一）無菌操作培養(yǎng)前準備：準備好所需物品清點無誤放置操作場所。培養(yǎng)室和超凈臺消毒：0.2％新潔爾滅拖地紫外線照射30-50min/d75%alcohol擦洗臺面紫外線消毒勿照射培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)液每天操作前洗手和著裝：嚴格按照外科手術要求消毒著裝，操作前75％alcohol消毒無菌培養(yǎng)操作：整個實驗過程保持無菌操作。點燃酒精燈，一切操作在火焰附近燒灼進行。燒灼時間勿過長防止退火。洗過培養(yǎng)液的吸管不能再燒灼。橡膠物品不能燒灼時間過長。吸管不能混用。（二）培養(yǎng)細胞的取材1.基本要求：

“快”，少于24h

“無菌”

用鋒利的器械切取組織減少損傷血液，脂肪，神經(jīng)組織等要棄去培養(yǎng)液營養(yǎng)要豐富，胎牛血清10-20％成功率：胚胎組織>成熟個體腫瘤組織>正常組織2.基本器材和用品眼科組織剪刀彎鑷手術刀（消毒）裝有無血清培養(yǎng)基或Hank’s液的小瓶小燒杯培養(yǎng)皿3.取材皮膚粘膜取材：上皮細胞培養(yǎng)來源內(nèi)臟和實體瘤：體內(nèi)所發(fā)生腫瘤及各臟器是常用材料血細胞：靜脈，耳垂或手指取血，肝素抗凝骨髓，羊水，胸水，腹水：離心后立即培養(yǎng)。鼠胚組織：引頸法處死整個浸入75％alcohol5min

固定于木板取材雞胚組織：將蛋以氣室向上置燒杯中消毒剪刀環(huán)行剪開蛋殼玻璃棒挑出雞胚

（三）組織材料分離細胞懸液：500-1000rpm低轉(zhuǎn)速離心5-10min

組織塊：機械分散法:剪刀剪取后反復吹打剪切分離法：剪或切成1mm3培養(yǎng)

消化分離法：

⑴胰蛋白酶法

使用最廣泛。適宜消化間質(zhì)少的軟組織如肝腎等，對硬癌組織效果差。所需時間較短，主要缺點是破損細胞。⑵膠原酶解離細胞法：對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。價格較高，大量使用增加成本。⑶EDTA法：較胰蛋白酶作用緩和，適宜消化分離傳代細胞。二、原代培養(yǎng)

取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

1.組織塊培養(yǎng)法：常用，簡單，成功率高。1000ml100ml2.消化培養(yǎng)法：快速得到大量活細胞，適宜培養(yǎng)大量組織，原代細胞產(chǎn)量高。步驟繁瑣，易污染，一些消化酶成本高，價格昂貴。3.器官培養(yǎng)：從供體獲得器官或器官組織塊后，不進行組織分離而直接在體外進行培養(yǎng)。要求：特殊培養(yǎng)條件r<1mm

足夠氧氣滲入三、傳代培養(yǎng)和細胞系的維持1.原代細胞的首次傳代傳代：細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程。是建立細胞系關鍵的時期。細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁大部分表面以前不要傳代。根據(jù)細胞不同消化時間具體處理。首次傳代細胞數(shù)量要多。2.細胞傳代方法貼壁生長：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。懸浮生長離心法傳代直接傳代法半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.細胞系的維持“換液”傳代”“再換液”“再傳代”“細胞凍存”4.培養(yǎng)細胞的純化⑴自然純化：利用某種細胞增殖優(yōu)勢排擠其它細胞。無法人為選擇，時間長，適于惡性腫瘤。⑵人工純化：酶消化法：利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶耐受性不同。機械劃除法：用橡皮刮子或彎頭滴管直接從瓶壁刮除。反復貼壁法：利用上皮細胞和成纖維細胞貼壁時間和穩(wěn)定性不同。培養(yǎng)基限定法：某些細胞在生長過程中必須存在或去處某種物質(zhì)。流式細胞儀分離法：利用細胞核酸含量，某些物質(zhì)含量或細胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)分離。5.原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期五、細胞凍存、復蘇和運輸細胞的凍存、復蘇和運輸教學目的1．掌握培養(yǎng)物的冷凍保存與復蘇原理2．掌握冷凍保存的常用方法3．掌握凍存細胞的常用復蘇方法4．掌握細胞運送的幾種方法□1776年Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對馬精子生命活動的影響的報道，用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，精子又“復活”.□1900年前后，基本肯定生物成分能夠在零下溫度貯存的事實?！?949年至1960年稱“甘油時期”?！?959年：二甲亞砜（DMSO）發(fā)展史一、培養(yǎng)物的的冷凍保存與復蘇1．概念１）冷凍保存(cryopreservation)：是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。2）復蘇(thawing)：是以一定的復溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復到常溫的過程3）因細胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細胞損傷被稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷(intracellularicedamage)。4）保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷(solutiondamage)原則：慢凍快融細胞的低溫冷凍儲存：

是細胞培養(yǎng)室的常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。⑴原理：在低于－70℃的超低溫條件下，細胞內(nèi)部的生化反應極其緩慢，甚至終止。

⑵原則：緩慢冷凍

當細胞冷到零度以下：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．冰晶就大，大冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細胞凍存所用用品⑶慢凍程序標準程序：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min

當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中細胞凍存器簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。液氮罐⑷低溫保護劑的應用滲透性：具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。常用的是DMSO，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

非滲透性：非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

⑸冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經(jīng)長期保存和復蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。（1）應控制凍存細胞的質(zhì)量。（2）不宜將凍存的細胞放置在0～－60℃過長時間。低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內(nèi)；（3）凍存小管宜采用塑料凍存管，不宜用玻璃安瓿。注意事項⒉細胞復蘇方法原則：快速復蘇（l）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）?；販睾髧娨?0%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)復蘇的細胞3.培養(yǎng)細胞的運輸冷凍儲存運輸：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻煩。充液法：選生長狀態(tài)好的細胞，生長1/3－1/2瓶底壁，棄掉舊培養(yǎng)液，補充新培養(yǎng)液至瓶頸留微量空氣，封口膜封口。貼身攜帶，達目的地后倒掉多余培養(yǎng)液，次日換液。四、細胞系及其鑒定

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細胞類型多而復雜。因此在培養(yǎng)初期，存活和生長的細胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細胞不斷地生長，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細胞，即細胞系(Cellline)。各種已被命名和經(jīng)過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株，都是一些形態(tài)比較均一、生長增殖比較穩(wěn)定的和生物性狀清楚的細胞群。1.細胞系鑒定當細胞系建立后，應對細胞系進行一系列鑒定后，才能應用于細胞生物學、免疫學、細胞遺傳學等方面的研究。細胞系的細胞來源鑒定細胞系的純度，即除了主類細胞外，還雜有哪類細胞細胞系的穩(wěn)定性，即在細胞連續(xù)培養(yǎng)過程中主要指標應無明顯變化累積細胞系的形態(tài)及其表達特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來源細胞的差異等2.細胞系鑒定指標⑴染色體：染色體是一種鑒定細胞系的種屬、性別來源較為確切的指標；也是檢查細胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標；是區(qū)別正常細胞與惡性細胞的指標。采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術檢測。⑵同工酶譜：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。

⑶細胞DNA遺傳特征:

3.細胞株建立要求及管理⑴記錄要求：

組織來源、細胞生物學檢測、培養(yǎng)條件和方法⑵鑒定、管理和使用

按國際慣例，在雜志或刊物上報道，詳細介紹上述各項目即可。各國管理中心、細胞庫美國標準細胞庫ATCC(AmericanTypeCultureCollection)、人遺傳突變細胞庫HGMR、細胞衰老細胞庫CAR

ATCC入庫細胞要求檢測項目（基本要求）：

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、供