抗原標(biāo)記蛋白分離線粒體方法的比較

抗原標(biāo)記蛋白分離線粒體方法的比較前言（Abstract）:線粒體是細(xì)胞的“powerhouse”，為提供細(xì)胞新陳代謝的能量的細(xì)胞器；此外，線粒體有自身的DNA和遺傳物質(zhì)，因基因組數(shù)量有限而成為一種具有半自主性的細(xì)胞器。因此線粒體的存在對(duì)細(xì)胞具有重要的意義。時(shí)下某些與線粒體有關(guān)疾病的發(fā)生或發(fā)生某種疾病時(shí)線粒體的變化，對(duì)于研究這類疾病（如癌癥等）以及如何治療這種疾病都有相關(guān)的醫(yī)學(xué)價(jià)值。隨著對(duì)線粒體的研究深入，分離得到線粒體的純度在其本身的研究中愈顯重要。迄今，分離線粒體的方法不勝枚舉，如電泳，離心等，但分離得到的線粒體的純度不盡相同。要想得到高純度度線粒體，能將線粒體從細(xì)胞內(nèi)一個(gè)一個(gè)“拿”下來(lái)是最好不過(guò)的。我們的問(wèn)題在于誰(shuí)去拿呢？在這種情況下，抗原抗體結(jié)合的特異性為我們打開了很好的一扇門。這里所提出的方法基于抗原抗體（Ag-Ab）反應(yīng)的專一性，可以特異性的相互結(jié)合。根據(jù)這一原理，如果在線粒體膜上特定的蛋白，用相關(guān)的抗原進(jìn)行標(biāo)記，在分離的過(guò)程中通過(guò)相應(yīng)的抗體則可以將線粒體完全的分離開來(lái)，這樣就可以分離得到高純度的線粒體。主體：線粒體膜蛋白（Theproteinsofmitochondrialmembrane）:線粒體是雙層膜的細(xì)胞器。根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，功能越是多的結(jié)構(gòu)其組成越是復(fù)雜，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的數(shù)量和種類上。線粒體無(wú)時(shí)無(wú)刻不在提供細(xì)胞生理活動(dòng)所需的能量，它對(duì)細(xì)胞的重要性這邊就不再贅述。也就是說(shuō)線粒體雙層膜上含有豐富的蛋白質(zhì)，如腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、棕色脂肪組織的解偶聯(lián)蛋白、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、TOM-22以及D-3羥丁酸脫氫酶等。這篇文章的主要目的在于運(yùn)用抗原標(biāo)記抗體識(shí)別的技術(shù)對(duì)幾種蛋白標(biāo)記分離線粒體的方法的比較。一、TOM-22&Anti-TOM22[2]：1、TOM-22蛋白是存在于線粒體外膜上轉(zhuǎn)位酶的三個(gè)亞單位之一（成分為：TOM40、TOM7、TOM22），在真菌和真核生物的線粒體轉(zhuǎn)位酶內(nèi)所起到的作用是益是弊現(xiàn)在還沒(méi)有個(gè)定論。其抗體為Anti-TOM22。2、分離過(guò)程：取樣。人或任何真核生物體組織細(xì)胞都可以作為線粒體的來(lái)源。根據(jù)線粒體分布差異，取線粒體較多的組織塊。II.組織細(xì)胞的溶解:獲取不同人細(xì)胞系大約融合90%并用PBS洗滌兩次，1X10八7在1ml的用冰預(yù)冷的PBS溶液中，溶液中含有完備的蛋白抑制混合片劑并被一根針剪切大約20次?？紤]到細(xì)胞的不同大小，不同直徑的針用于細(xì)胞的碎裂：26G用于293人胚腎細(xì)胞，29G用于Hela細(xì)胞，27G用于骨肉瘤細(xì)胞的破裂。玻璃勻漿機(jī)用于碎裂大量的細(xì)胞。取洗滌液一等分溶液，通過(guò)錐蟲藍(lán)排斥反應(yīng)來(lái)確定80%的細(xì)胞已經(jīng)溶解。［2］III.分離過(guò)程：1、 凝膠柱的分離：將抗體anti-TOM22加到充滿凝膠顆粒的層析柱中,取先前的細(xì)胞溶解液，分次等量的通過(guò)凝膠柱。由于抗原抗體反應(yīng)的特異性，含有TOM22蛋白的線粒體則、被吸附在凝膠顆粒中，由此將線粒體從混合溶液中分離開來(lái)。吸附在凝膠上的線粒體與抗體結(jié)合，用PH低于TOM22等電點(diǎn)的鹽酸溶液多次清洗凝膠柱，破壞其抗原抗體之間的作用力，使得二者分開，即可得到高純度的線粒體。2、 超順磁珠分離（superparamagneticmicrobeads）1）、超順磁珠：anti-TOM22microbeads。磁珠是極其小的（直徑為50納米）超磁力微粒物的膠體懸浮液。［2］通過(guò)抗原抗體結(jié)合在線粒體的外膜上，按照上述方法組織細(xì)胞溶解后，將溶解液放在一個(gè)強(qiáng)磁場(chǎng)中，根據(jù)磁場(chǎng)中的作用力進(jìn)行分離。3、 方法可行性的分析一、凝膠柱分離：凝膠柱分離是一種較為普遍的分離方式，主要利用分子量的大小來(lái)進(jìn)行分離。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)加強(qiáng)了凝膠對(duì)特定物質(zhì)的吸附性。經(jīng)過(guò)數(shù)次的過(guò)濾后，通過(guò)改變反應(yīng)的PH值，即如上所說(shuō)的用PH低于TOM22的等電點(diǎn)的鹽酸清洗凝膠柱，從而破壞其抗原抗體之間的作用力。但這種方法由于分離抗原抗體是其他雜質(zhì)的引入，使得分離出來(lái)的線粒體的純度受到干擾。

二、超順磁珠的分離：（MACS）1）、產(chǎn)出率為了確定這種方法能夠成功的分離出線粒體，取一個(gè)人胚腎293報(bào)道分子細(xì)胞系持續(xù)不斷的表達(dá)EGFP（綠色熒光蛋白）與來(lái)自于細(xì)胞色素C氧化酶的亞基伽的前體的線粒體定向序列相互融合，結(jié)果可見如圖［1］：Fig.1.FACSanalysisofmitochondriaisolatedfromtransfected293HEKcellsusingtheMACSprotocol.Mitochondriaintransfected293HEKcellsexpressEGFPfusedtoamitochondrialtargetingsequenceand,therefore,arefluorescentlylabeled.Thegreenlinedisplaysthespecificfluorescenceofmitochondria,whereasthegrayarearepresentstheautofluorescenceofmitochondriafromuntransfected293HEKcells.Comparedwiththecrudecelllysatebeforeisolation(A),themitochondrialfraction(C)showsasignificantenrichmentofmitochondria,whereashardlyanysignalwasdetectableintheflow-throughandwashfractions(B).Anoverlayofthecrudecelllysateandmitochondrialfraction(D)confirmsthespecificenrichmentofmitochondriaobtainedwiththeMACSprotocol.

2）、線粒體的富集蛋白印跡分析［1］顯示出線粒體蛋白的數(shù)目，比如內(nèi)膜上的細(xì)胞色素c氧化酶，外膜的TOM22，線粒體核蛋白TFAM，和細(xì)胞色素c通過(guò)MACS分離得到的線粒體碎片顯著增多。表明在被洗滌出來(lái)的碎裂片線粒體有著的富集。［2］COXITOM22Gdgin97TFAMCytCP-aobnRab4Fig.2.(A)Enrichmentofmitochondria.TheamountsofsubunitIofcomplexIV(COXI),22-kDatranslocaseofoutermitochondrialmembrane(TOM22),mitochondrialtranscriptionfactorTFAM(TFAM),andcytochromecCOXITOM22Gdgin97TFAMCytCP-aobnRab4Fig.2.(A)Enrichmentofmitochondria.TheamountsofsubunitIofcomplexIV(COXI),22-kDatranslocaseofoutermitochondrialmembrane(TOM22),mitochondrialtranscriptionfactorTFAM(TFAM),andcytochromec(Cytc)inwholecelllysatewerecomparedwithequalamountsofproteinfromthemitochondrialfractionisolatedfromHeLacellsusingtheMACSprotocol.(B)Theamountsof-&ctin,GAPDH,Rab4,andGolgin-97,representingproteinsfromcytoskeleton,cytosol,Golgiapparatus,andendosome,respectively,inwholecelllysatewerecomparedwiththeequalproteinamountsfromthemitochondrialfractionisolatedfromHeLacellsusingtheMACSprotocol.(C)AmountsofCOXI(mitochondria),KDEL(endoplasmicreticulum),andlaminsAandC(nucleus)inthemitochondrialfractionsobtainedusingDC,theMACSapproach,andUC.、線粒體的純度MACS分離得到的線粒體會(huì)有來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、高爾基復(fù)合體、胞核和胞液。運(yùn)用蛋白免疫印記分析，以這些污染物中某些蛋白質(zhì)為抗原，利用相對(duì)應(yīng)的抗體如B-Actin,GAPDH,Golgin-97andRab4，能分別識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞骨架、胞液、高爾基復(fù)合體和胞內(nèi)體，從而出去相關(guān)的污染物。分別的與通過(guò)DC的方法分離的到的線粒體相比。［5］通過(guò)UC分離得到的線粒體含有相近數(shù)量的來(lái)自線粒體和核內(nèi)的污染物。［7］因此，相對(duì)來(lái)說(shuō)MACS分離線粒體的方法是相對(duì)較為理想的。二、D-3羥丁酸脫氫酶（BDH）：D-3羥丁酸脫氫酶（結(jié)構(gòu)如上圖：［18］）是位于線粒體內(nèi)膜上的膜結(jié)合酶。［8］其活性中心主要位于基體的旁邊催化線粒體的新陳代謝，產(chǎn)生兩種重要的代謝產(chǎn)物:3-羥基酸丁鹽和乙酰乙酸。［5］此外它還是一種依賴NAD陽(yáng)離子的酶。通過(guò)綠銅假單皰菌可以獲得D-3羥丁酸脫氫酶的抗體，借此可以特異性的識(shí)別結(jié)合D-3羥丁酸脫氫酶，分離線粒體。I、 材料的準(zhǔn)備：因依賴DNA陽(yáng)離子的D-3羥丁酸脫氫酶可以可逆性的將D-3羥基酸丁鹽轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸，在線粒體氧化還原反應(yīng)和能量代謝中起到關(guān)鍵性的作用。選用Jerboa作為實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。［5］Jerboa是一種夜行的是嚙齒類動(dòng)物，主要生活在摩洛哥高地上。其具有驚人的耐高溫，耐寒，耐干燥的特征，是一份很好的實(shí)驗(yàn)材料。BDH多克隆抗體的制備：多克隆抗體anti-BDH可以通過(guò)從原核生物銅綠假單胞菌體內(nèi)的BDH通過(guò)相關(guān)的技術(shù)如利用家兔或其他一些手段等制備相關(guān)抗體。在溫度為35°C，PH為4~10之間時(shí),BDH與其抗體能夠很穩(wěn)定的結(jié)合，而在大于50°C或者在17C時(shí)，抗原抗體之間的相互作用力會(huì)變小或者消失，從而導(dǎo)致抗原抗體的分離，使獲得純化的目標(biāo)物質(zhì)。II、 分離：BDH可以通過(guò)antigen-antibody反應(yīng)來(lái)進(jìn)行分離提純，則說(shuō)明，D-3氫丁酸脫氫酶可以被相應(yīng)的抗原識(shí)別，進(jìn)而在分離出線粒體。BDH通過(guò)從銅綠假單胞菌中分離提純出相應(yīng)的多克隆抗體。［5］然后在取Jerboa肝臟的細(xì)胞，通除垢劑（cholate或者TritonX-100）或者通過(guò)磷脂酶A2產(chǎn)生的溶血磷酯素類來(lái)使細(xì)胞膜增溶從而破裂。在洗滌數(shù)次（如利用TOM22中所提到的方法）后，取一等分洗滌液，在35C，PH4~10的條件下，通過(guò)裝有anti-D-3羥丁酸脫氫酶的凝膠柱中，則因含有D-3羥丁酸脫氫酶的線粒體被吸附在凝膠柱，其他的細(xì)胞器則因重力作用流出凝膠柱。洗滌數(shù)次后，調(diào)節(jié)溫度至17C或50C以上，就可以將anti-BDH與BDH分開，在用蒸餾水洗滌2~3次，從而得到純凈的線粒體溶液。

m、樣品的回收：凝膠中吸附了大量的線粒體，通過(guò)改變溫度來(lái)使抗原抗體進(jìn)行分離，并用蒸餾水進(jìn)行洗滌，因而這種方法收集得到的線粒體不含有其他的雜質(zhì)，純度相對(duì)較高。并且由于BDH的活性受溫度的影響很大，因而當(dāng)溫度達(dá)到高于50°C時(shí)，抗原抗體之間的作用力幾乎消失，樣品的回收率也是有保證的。由于BDH與anti-BDH存在一對(duì)一的關(guān)系，而一個(gè)線粒體也對(duì)應(yīng)些許BDH。因此通過(guò)檢測(cè)分離BDH所得到的純度可以間接反映獲得線粒體的純度。PurificationstepsofBDHfromjerboaliverTotalprotein(mg)Specificactivity(nmol/min/mgofprotein)Totalactivity(pmol/min)Purificationfactor(fold)Yield(%)CrudeextractAmmonium5100100sulphate(30-50%)Phen560*82yl-Sepharose35065Sepharose-BlueImmu5017.60.8716.016noaffinitychromatography0.7541.30.03037.50.50Typicalexperimentswerereportedfromthreeindependenttrials.*Theammoniumsulphateprecipitationstepeliminates91%ofcontaminatingproteinsfromJerboacrudeextracts,respectively.ThesevalueswerecalculatedfromthetotalproteinamountdeducedfromtheamountofBDH(estimatedfromspecificactivitiesaftertheimmunoaffinitychromatographystep).chromatographystep).[5]根據(jù)上述表格中的數(shù)據(jù)簡(jiǎn)要的總結(jié)了BDH分離的結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，比活在0.030U/mg蛋白質(zhì)時(shí)最高，而此時(shí)分離得到的酶的產(chǎn)率最低為0.05%的總量和37的purificationfactor.從而由純度較高的BDH獲得線粒體的量相對(duì)較少。此外，與前一種方法相比，由于前者在分離洗滌過(guò)程中通過(guò)改變PH來(lái)進(jìn)行anti-TOM22與TOM22分離，則必須加入酸性物質(zhì)，從而必不可少的引入了雜質(zhì)。雖然鹽酸為揮發(fā)性酸，但其氯離子或多或少仍能夠溶于水中，則線粒體的純度收到了影響。在樣品回收這方面，由于酸的介入，線粒體上一些蛋白的性質(zhì)則會(huì)發(fā)生改變，因而樣品的回收率也不如通過(guò)改變溫度進(jìn)行回收的地第二種方法來(lái)的高。三、蘋果酸脫氫酶(MDH)及其同工酶：Holzer和他的合作者在一系列的論文中講述了啤酒酵母菌中蘋果酸脫氫酶的奇怪的行為。[9]~[15]Wittetal通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明依賴葡萄糖生長(zhǎng)的細(xì)胞中只含有線粒體酶的活性，而在沒(méi)有葡萄糖的情況下，在細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，兩種同工酶的抗體可以從兔子中獲得，線粒體蘋果酸脫氫酶的抗血清與這兩種同工酶都可以發(fā)生反應(yīng)。因此要想通過(guò)蘋果酸脫氫酶與其抗體結(jié)合反應(yīng)分離出線粒體，必須通過(guò)一定的方法將胞質(zhì)中的蘋果酸脫氫酶出去，進(jìn)而在進(jìn)行分離。胞質(zhì)中的蘋果酸脫氫酶大多分布于細(xì)胞膜上，因此破壞細(xì)胞膜成為我們分離線粒體的首要任務(wù)。I、細(xì)胞的培養(yǎng)：如上所說(shuō)，細(xì)胞在不同的環(huán)境和中生長(zhǎng)所得到的細(xì)胞是不一樣的。按照EdgarHAGELE,JiirgenNEEFF,andDieterMECKE所提出的方法，我們可以得到符合條件的細(xì)胞材料。培養(yǎng)好的細(xì)胞存放-20°C環(huán)境中。[16]II蘋果酸脫氫酶抗體的制備：除掉參比血清之后，如Williams和Chase所描述的那樣用動(dòng)物進(jìn)行免疫。在該實(shí)驗(yàn)的最后將血從耳后靜脈取出。在25C將制備好的純凈的蘋果酸脫氫酶或者粗的浸膏劑加入到大量的抗血清中30分鐘，使發(fā)生膠合。再通過(guò)離心機(jī)分離。III、細(xì)胞膜的破壞與分離：將培養(yǎng)好的細(xì)胞放在含有NaHCO、PH為7.5緩沖液的冰水混合溶液中，在Dounce離心機(jī)里面進(jìn)行分離，從而將細(xì)胞膜分離出去。[17]W、線粒體的分離過(guò)程：應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)，因排除了細(xì)胞膜上蘋果酸脫氫酶的干擾，通過(guò)含有蘋

果酸脫氫酶抗體的凝膠柱后，只有含有蘋果酸脫氫酶的細(xì)胞器即線粒體能夠吸附在凝膠柱上。取一等分的濾出液通過(guò)凝膠柱，重復(fù)幾次。然后用equilibrationbuffer(20mMTris/HCl,1mMEDTA,1mMmercaptoethanolpH7.0徹夜洗滌，在0.5M的KCl和2MNaCl的作用下就可以將線粒體與抗蘋果酸脫氫酶分離開來(lái)。[16]V、樣品的回收以及試驗(yàn)方法的評(píng)價(jià):rime(h)&LUJ5二苔XLMdc1、 蘋果酸脫氫酶的活性大小影響著分離得到的線粒體的純度。從葡萄糖這方面考慮：葡萄糖的多少與蘋果酸脫氫酶活性的關(guān)系如下圖所示：［16］從曲線的走向趨勢(shì)可以看出葡萄糖對(duì)該酶的活性有著顯著地影響。當(dāng)加入葡萄糖5h的時(shí)候活性達(dá)到最大，此時(shí)分離線粒體最容易，也是產(chǎn)率最大的時(shí)候。但時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)對(duì)改點(diǎn)分離得到的線粒體的純度以及產(chǎn)率都有很大影響。由坡度可見。rime(h)&LUJ5二苔XLMdc2、 由于蘋果酸脫氫酶既存在于細(xì)胞的線粒體中又存在于細(xì)胞膜中，而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需要的細(xì)胞是要通過(guò)培養(yǎng)所得，并不是說(shuō)所有的細(xì)胞都可以。這方面存在一定的局限性，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中想要得到puremitochondria是一件比較困難的事情；3、 在分離線粒體之前，雖然將細(xì)胞膜出去，但也不能保證細(xì)胞質(zhì)中就沒(méi)有其他的含有游離的蘋果酸脫氫酶的成分存在；4、 在抗原抗體分離的過(guò)程中也存在一定的不確定因素?？乖贵w分離過(guò)程中也可能會(huì)引入其他雜質(zhì)。如改變PH，則必須引入酸性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)溶液的酸堿度。且在收集的線粒體的純度方面也是要大打折扣的。因此，這種方法相對(duì)于前三種方法相比其回收率是比較低的;總結(jié)(conclusion)：Antigen-antibody的結(jié)合是一種特異性的結(jié)合方式，具有很強(qiáng)的專一性。利用其進(jìn)行分離一些目標(biāo)物質(zhì)其純度是可以得到很好的保證的。由于線粒體是細(xì)胞的功能細(xì)胞器，是細(xì)胞的發(fā)電廠，在細(xì)胞的新陳代謝方面具有很重要的作用；又因其具有半自主復(fù)制的特性，因此對(duì)它的研究也就顯得尤為重要。本文所提到的幾種分離得到純凈線粒體的方法都是通過(guò)抗原抗體特異性的結(jié)合得到的，雖然在方法的大同小異，但不同抗原蛋白的選取對(duì)于實(shí)驗(yàn)的難易程度以及實(shí)驗(yàn)操作的便宜程度都具有重要的意義。尤其是最后我們選擇蘋果酸脫氫酶，可以說(shuō)這份材料的選擇就相當(dāng)?shù)牟贿m合，雖然它有些許地方的可取之處。但就其純度和線粒體的回收率方面都沒(méi)有先前兩種方法來(lái)的高。總的來(lái)說(shuō)，線粒體的分離或許有好多方法可以實(shí)現(xiàn)，但抗原抗體反應(yīng)這種專一性的分離方法是永遠(yuǎn)不會(huì)被最后考慮到的。參考文獻(xiàn)：姜彬.蛋白質(zhì)免疫印記分析法實(shí)驗(yàn)條件的研究 [J]實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理1002-4956(2008)05-0053-03Hue-TranHornig-Do,GrittGunther,MariaBust,etal.Isolationofmitochondriabysuperparamagneticmicrobeads[J]AnalyticalBiochemistry389(2009)1-5GBellot,P-FCartron,EEr,etal.Acorecomponentofthemitochondriaoutermembraneproteintranslocationpore,isamitochondrialreceptorfortheproapoptoticprotein[J]BaxCellDeathandDifferentiation(2007) 14, 785-794. doi:10.1038/sj.cdd.4402055;publishedonline10November2006TOM22,RussellGrimwade,Parkville,CrawleyTom22'.Tom22',an8-kDatrans-SiteReceptorinPlantsandProtozoans,IsaConservedFeDrissMountassif,PierreAndreoletti,ZakariaElKebbaj,etal.Immunoaffinitypurificationandcharacterizationofmitochondrialmembrane-boundD-3-hydroxybutyratedehydrogenasefromJaculusorientalis[J]BMCBiochemistry2008,9:26E.Fernandez-Vizarra,M.J.Lopez-Perez,J.A.Enriquez,Isolationofbiogeneticallycompetentmitochondriafrommammaliantissuesandculturedcells,Methods26(2002)292-297.N.K.Scheffler,S.W.Miller,A.K.Carroll,etal.Two-dimensionalelectrophoresisandmassspectrometricidentificationofmitochondrialproteinsfromanSH-SY5Yneuroblastomacellline,Mitochondrion1(2001)161-179.LatruffeN,GaudemerY:PropertiesandKineticmechanismofD-3-hydroxybutyratedehydrogenasefromratliversubmitochondrialparticles,Comparativeseffectsofdifferentthiolreagents.Biochimie1974,56:435-444.Witt,I.,Kronau,R.&Holzer,H.(1966)Biochim.Biophys.Ac~u118,,122-1