課題三血紅蛋白的提取和分離

課題3血紅蛋白的提取和分離1、含量：占細胞干重的50％以上，是細胞中含量最多的有機化合物。2、組成元素：C、H、O、N3、基本單位：氨基酸蛋白質(zhì)小知識氨基NH2COOH羧基HR—C—4、分子結(jié)構(gòu)：氨基酸多肽蛋白質(zhì)肽鍵：—CO—NH—5、相對分子質(zhì)量：高分子化合物蛋白質(zhì)小知識脫水縮合盤曲折疊1、分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2、蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力，等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。思考凝膠色譜法（分配色譜法）1、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）相對分子質(zhì)量的大小，利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離。性質(zhì)：微小的多孔球體本質(zhì)：多糖類化合物實例：葡聚糖、瓊脂糖凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)凝膠色譜法（分配色譜法）2、原理：

當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。相對分子質(zhì)量大小直徑大小大于凝膠顆?？椎乐睆叫∮谀z顆粒孔道直徑運動路徑被阻擋在凝膠顆粒外面而迅速通過因擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留運動速度較快較慢運動路程較短較長洗脫次序先后緩沖溶液1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的溶液。2、作用：能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的pH的影響，維持pH基本不變。3、配制：通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。還記得人體血液中的緩沖液嗎？H2CO3/NaHCO3

NaH2PO4/Na2HPO4你認為在血紅蛋白整個實驗中用的緩沖液是什么？目的是什么？本實驗使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和科學(xué)研究（活性）。電泳1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2、原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3、類型：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳應(yīng)用：測定蛋白質(zhì)分子量、進行蛋白質(zhì)純度鑒定原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除凈電荷對遷移率的影響。電泳實驗操作步驟樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定

水分血漿固體物質(zhì)血液白細胞血細胞血小板紅細胞血紅蛋白（90％）血紅蛋白的組成β

βα

α血紅素基因可攜帶一分子O2或一分子CO21、紅細胞的洗滌2、血紅蛋白的釋放3、分離血紅蛋白溶液4、透析（一）樣品處理問題：1、剛采集的血樣要做怎樣的處理？為什么？加入抗凝血劑，防止血液凝固。2、怎樣洗滌？采樣分離－吸漿倒紅－加液攪拌－重洗三次低速短時間離心生理鹽水1、紅細胞的洗滌3、洗滌的目的是什么？去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。4、洗滌干凈的標(biāo)志是什么？直至上清液不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。1、紅細胞的洗滌2、血紅蛋白的釋放問題：加蒸餾水和甲苯的作用是什么？使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。

有機溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）3、分離血紅蛋白溶液高速離心－濾紙過濾－漏斗分液（二）凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作打孔→挖穴→安管→覆網(wǎng)→紗包→插管2、凝膠色譜柱的裝填固定色譜柱→配凝膠懸液→裝填色譜柱→洗滌平衡3、樣品的加入和洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面→滴加透析樣品→樣品滲入凝膠床→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)2、凝膠色譜柱的裝填固定色譜柱－配凝膠懸液－裝填色譜柱－洗滌平衡磷酸緩沖液沸水浴加熱緊密

(pH為7.0)不得有氣泡（二）凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面→滴加透析樣品→樣品滲入凝膠床→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)磷酸緩沖液(1)不要觸及破壞凝膠面(pH為7.0)(2)貼壁加樣

(3)使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動（二）凝膠色譜操作蛋白質(zhì)的提取和分離步驟1、樣品處理通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集血紅蛋白溶液。2、粗分離經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)。3、純化通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。4、純度鑒定通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定。收集得到的純化后的血紅蛋白血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定問題：1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。2、與其他真核