核酸的分離與純化

第二章核酸檢測(cè)技術(shù)

朱慧分子診斷技術(shù)通常以目的核酸作為診斷靶標(biāo)，通過(guò)核酸擴(kuò)增、核酸雜交、核酸序列分析等技術(shù)檢測(cè)基因或者基因的改變，可作為疾病診斷的依據(jù)。優(yōu)越性：高度的靈敏度和特異性疾病診斷易感性評(píng)估疾病的分型、分期預(yù)后判斷和療效判斷第一節(jié)核酸分離與純化核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過(guò)3’,5’—磷酸二酯鍵連接成的一類生物大分子，包括核糖核酸RNA和脫氧核糖核酸DNA兩類。真核生物原核生物染色體DNA（細(xì)胞核內(nèi)，雙鏈線狀）細(xì)胞器DNA（線粒體或葉綠體，雙鏈環(huán)狀）染色體DNA

（雙鏈環(huán)狀）質(zhì)粒DNA一、核酸分離純化的基本原則與步驟（一）核酸分離純化的基本原則1.保持核酸結(jié)構(gòu)的完整性pH4~10機(jī)械剪切力0~4度核酸酶2.盡量排除其他分子的污染蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)這類生物大分子雜質(zhì)；對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子；其他核酸分子。（二）核酸分離純化的步驟1.核酸的釋放機(jī)械法不適合真核基因組DNA非機(jī)械法（干燥法和溶胞法）（溶胞法應(yīng)用最廣泛）

在含有核酸分子復(fù)雜混合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離：非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液。2.核酸的分離純化3.核酸的濃縮、沉淀與洗滌

（1）核酸的濃縮固體聚乙二醇（PEG）濃縮：將DNA溶液裝入透析袋，包埋于PEG使DNA脫水。丁醇抽提濃縮：正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振蕩混合后離心，去除有機(jī)相，可顯著減少DNA體積。沉淀是濃縮核酸最常用且高效的方法。沉淀可以很容易地將核酸溶液調(diào)至所需濃度，同時(shí)還可以改變?nèi)芙夂怂岬木彌_液種類，可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子。加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）沉淀核酸，少量鹽類可使用70~75%的乙醇洗滌。

（2）核酸的沉淀與洗滌（三）核酸的鑒定與保存1.核酸的鑒定(1)濃度鑒定(2)純度鑒定(3)完整性鑒定（1）核酸濃度鑒定1）紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，33μg/ml單鏈寡核苷酸）

2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠EB，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）強(qiáng)致癌性。（2）核酸純度鑒定1）紫外分光光度法：通過(guò)A260

與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)污染和鑒定核酸純度。純的DNAA260與A280之比應(yīng)在1.8，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份，高于此值表明有RNA的殘留量。純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0。

A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。

2）熒光光度法

用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。DNA、RNA（3）核酸完整性鑒定凝膠電泳法：

基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；

總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。

正常時(shí)，28SRNA的熒光強(qiáng)度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解。2.核酸的保存

（1）DNA的保存（2）RNA的保存（1）DNA的保存

1.短期貯存：

4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH為8.0時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，pH低于7.0時(shí)DNA容易變性。2.長(zhǎng)期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。（2）RNA的保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶解可以抑制RNA酶對(duì)RNA的降解。由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)核酸樣品有斷裂作用，在實(shí)際保存時(shí)，最好將核酸制品小量分裝保存。二、DNA的分離純化（一）基因組DNA的分離純化（二）質(zhì)粒DNA的分離純化（一）基因組DNA的分離與純化（一）基因組DNA的分離純化

基因組是單倍體細(xì)胞中的全套基因，是生物在分子層面上的一份生命“說(shuō)明書”。原核生物：一條環(huán)狀染色體構(gòu)成；真核生物：核基因組

細(xì)胞質(zhì)基因組線粒體基因組葉綠體基因組1、真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化核內(nèi)染色體DNA一種惰性很強(qiáng)的分子DNA雙鏈由氫鍵相連，潛在的反應(yīng)基團(tuán)在螺旋內(nèi)部，堿基對(duì)位于外側(cè)并受磷酸和糖的保護(hù)，因此其內(nèi)部的堿基堆積力相互作用進(jìn)一步加強(qiáng)，使染色體DNA在細(xì)胞內(nèi)比其他成分具有更好的化學(xué)耐受性。相對(duì)分子量大的DNA在物理上仍是易碎的，它在溶液中為長(zhǎng)且彎曲的狀態(tài)，易發(fā)生隨機(jī)卷曲，并因堿基堆積力和磷酸基團(tuán)間的靜電斥力變得黏滯，在吸液、攪拌、振蕩等操作引起的剪切力作用下易斷裂，且造成沉淀后較難溶解。因此基因組DNA易以片段形式被分離。常規(guī)操作中，大于150kb的DNA大多會(huì)被切斷。DNA的相對(duì)分子質(zhì)量越大的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA因?qū)C(jī)械剪切力敏感，提純時(shí)很難保證其完整性，而對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量小的噬菌體DNA，采用常規(guī)方法也不會(huì)造成其DNA的斷裂。DNA樣品準(zhǔn)備

常見(jiàn)的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等。生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存-70℃或液氮。在提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免DNA斷裂和降解提取方法：1、溫和裂解細(xì)胞并溶解DNA，使DNA與組蛋白分離，并完整地以可溶形式分離出來(lái)。2、采用酶學(xué)或化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子。

真核細(xì)胞的破碎裂解方法超聲破碎法勻漿法低滲法

蛋白酶K

去污劑（1）酚抽提法：本法最初于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立。

改進(jìn)方法：

EDTA和SDS存在下，蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH

8.0的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。

獲DNA大小為100-150kb。重復(fù)抽提至一定純度后(2~3次)，根據(jù)不同需要行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA樣品。透析和沉淀主要是去除提取過(guò)程中混入的有機(jī)物及鹽類，這些物質(zhì)可能對(duì)后續(xù)試驗(yàn)有影響。透析處理能減少對(duì)DNA的剪切效應(yīng)，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀處理常以乙酸銨為鹽類，用2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗滌去除鹽，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。主要試劑的作用

EDTA：1.二價(jià)金屬離子螯合劑，抑制DNA酶活性；

2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。SDS：陰離子去垢劑1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；3.對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。蛋白酶K：廣譜蛋白酶

水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。無(wú)DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。pH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。運(yùn)用該法可以從單層或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織及血液標(biāo)本中制備10到數(shù)百μg的DNA樣品。由于分離純化的每一步都有剪切力的影響，最后得到的DNA樣品中分子量超過(guò)100kb～150kb的很少，但這種大小的DNA足以作為PCR反應(yīng)的模板和進(jìn)行Southernblotting分析以及構(gòu)建以λ噬菌體為載體的基因組DNA文庫(kù)。從5×107個(gè)培養(yǎng)的非整倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）大約可以制備分子量在100kb～150kb的DNA200μg，自20ml血液可得250μg。溫和:盡量減少酚-氯仿抽提次數(shù)

混合時(shí)要溫和

盡量保證DNA完整性兩個(gè)原則：

防止DNase對(duì)DNA的降解減少對(duì)DNA的機(jī)械破壞（2）

甲酰胺解聚法破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟；甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品。可得DNA200kb左右。甲酰胺是一種離子化溶劑，既可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，還可使釋放的蛋白質(zhì)變性。但甲酰胺對(duì)蛋白酶K的活性無(wú)顯著影響。濃度低（3）玻璃棒纏繞法用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀于細(xì)胞裂解液與乙醇液的交界面；二是要將沉淀的DNA纏繞于帶鉤玻棒上，通過(guò)帶鉤玻棒將高分子量DNA沉淀從乙醇溶液中轉(zhuǎn)移到pH8.0的TE溶液重溶。（4）

異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）。（5）玻璃珠吸附法：直徑5~25μmDNA樣品的純化：透析、層析、電泳及選擇性沉淀。電泳法簡(jiǎn)單、快速，是DNA樣品純化最重要的方法。瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。聚丙烯酰胺電泳（PAGE）分辨率高（1bp或1nt），電泳容量較瓊脂糖凝膠電泳大，有效分離范圍為6-2000bp，適用于小片段DNA的純化。

瓊脂糖含量％（W/V）線性DNA分離范圍（Kb）

0.3

5-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1–2瓊脂糖電泳：分辨率低，適用50bp~Mb大片段DNA純化。原核生物包括細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體、放線菌和藍(lán)綠藻等，是最簡(jiǎn)單的細(xì)胞生物體。感染性疾病診斷復(fù)雜2、原核細(xì)胞基因組DNA的分離純化原核生物DNA制備困難分子較大（2×109bp），易受機(jī)械剪切力破壞種類比病毒復(fù)雜破壁比較困難分離步驟1、破碎菌體2、去除蛋白質(zhì)3、去除RNA避免機(jī)械剪切力和脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解（1）破碎菌體充分破碎細(xì)胞壁SDS或溶菌酶（革蘭陽(yáng)性菌）EDTA、蔗糖（2）去除蛋白質(zhì)鹽析法和有機(jī)溶劑處理的方法鹽析法：在溶菌酶和SDS溶菌后直接加入固體NaCl或NaClO4

鹽析，離心除去蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑使蛋白變性，離心分層后，變性蛋白將在水相與有機(jī)相之間的界面析出，很容易除去。（3）去除RNA

核糖核酸酶CsCl密度梯度離心或蔗糖密度梯度離心異丙醇選擇性沉淀DNA（4）常用方法及比較：

溶菌酶法革蘭陽(yáng)性菌CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）大多數(shù)微生物，較純超聲破碎法劇烈，DNA部分降解3、病毒基因組DNA的分離純化純化病毒粒子SDS或酚處理或兩者結(jié)合處理避免劇烈振蕩及攪拌，寬口吸管吸取DNA溶液SDS-酚法

（二）質(zhì)粒DNA的分離與純化

質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒。這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀半開(kāi)環(huán)DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂線性DNA，即質(zhì)粒DNA在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂。通常抽提的質(zhì)粒在電泳后往往出現(xiàn)3條帶，其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線性DNA，最慢的為半開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒特性1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記6.限制性內(nèi)切酶單一切口質(zhì)粒DNA的提取和純化

1．細(xì)菌的培養(yǎng)先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。2．細(xì)菌的收集與裂解細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用LB培養(yǎng)基懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。3.質(zhì)粒DNA的抽提質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增質(zhì)粒DNA的釋放質(zhì)粒DNA的分離純化

質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的中量制備20-50ml

質(zhì)粒DNA的大量制備500ml

堿裂解法方法煮沸法

SDS裂解法質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

常用的煮沸法，堿法，SDS法均可獲得較滿意效果。至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題。1、堿裂解法

簡(jiǎn)單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法。在NaOH提供的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞膜使細(xì)胞裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)DNA及蛋白質(zhì)。當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)天然超螺旋，而染色體DNA不能再?gòu)?fù)性。在高鉀鹽條件下，變性的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合并與染色體DNA及細(xì)胞碎片纏繞在一起形成大的復(fù)合物而發(fā)生共沉淀，質(zhì)粒DNA則保留于上清中通過(guò)離心得以分離。用預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，并用70%的乙醇洗滌，其純度可滿足DNA測(cè)序與PCR等實(shí)驗(yàn)的要求。強(qiáng)堿溶液使染色體DNA及蛋白質(zhì)變性，但質(zhì)粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只發(fā)生輕微變性。堿裂解法是一種適用范圍很廣的方法，能從所有的大腸桿菌（E.coli）菌株中分離出質(zhì)粒DNA，制備量可大可小。利用溶菌酶和TritonX-100破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)緊密而不會(huì)解鏈，溫度下降后，可重新恢復(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，回收上清液中質(zhì)粒DNA。2、煮沸裂解法

煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取相對(duì)分子質(zhì)量小(＜15kb)的質(zhì)粒DNA，適用于大多數(shù)E.coli菌株。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。不適用于表達(dá)核酸內(nèi)切酶EndA的菌株。3、SDS裂解法

比較溫和的抽提方法。將細(xì)菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解，酚-氯仿抽提。適合相對(duì)分子質(zhì)量大(＞15kb)的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高。4、其他方法小量一步提取法：直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，同時(shí)完成細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)變性兩個(gè)過(guò)程，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)與染色體DNA，最后從上清中回收質(zhì)粒DNA。本法簡(jiǎn)單快速、成本低，可用于內(nèi)切酶圖譜分析。牙簽少量制備法：用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在平板上的細(xì)菌菌落來(lái)制備質(zhì)粒DNA，此法制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，故不能用于分子克隆的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。5、質(zhì)粒DNA純化

質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)以后，為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。氯化銫-溴乙錠密度梯度平衡離心法（CsCl-EB法）是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長(zhǎng)，近年來(lái)，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級(jí)聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。

對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。（1）CsCl-EB法超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開(kāi)。回收的閉環(huán)質(zhì)粒DNA含有嵌入的EB，可采用有機(jī)溶劑抽提法或離子交換層析加以去除。經(jīng)典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、純化效果好，至今仍是質(zhì)粒DNA純化的首選方法。但該法很費(fèi)時(shí)并需要昂貴的設(shè)備與試劑。（2）

聚乙二醇沉淀法分級(jí)沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用RNase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒DNA，再利用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、適用廣，尤其對(duì)堿裂解法提取的質(zhì)粒純化效果好，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)，也能用于高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。但PEG法不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA。（3）柱層析法柱層析法純化質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵是用于填充層析柱的樹(shù)脂。樹(shù)脂可分為兩類：利用疏水的相互作用來(lái)純化質(zhì)粒DNA樣品；通過(guò)離子交換與吸附的相互作用進(jìn)行純化。在高鹽條件下，DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。高鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過(guò)暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖類物質(zhì)，再加入TE或水，離心洗脫。DNA與硅基質(zhì)的吸附作用與DNA的堿基組成和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，因此可用于環(huán)型質(zhì)粒DNA和線性DNA的純化。小于100bp～200bp的DNA分子由于與硅基質(zhì)的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的純化。但在純化大分子DNA時(shí)，可有效去除小分子DNA的污染。（三）DNA片段的回收主要是從電泳中分離回收DNA片段?；厥赵瓌t：盡量提高回收率；去除回收DNA樣品中的雜質(zhì)。1、DNA片段回收的原則和要求（1）回收率提高DNA樣品的上樣量，減少回收體積。（2）純度回收的DNA樣品常因支持介質(zhì)的不純、回收溶液的使用及操作不慎等因素而引入雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能嚴(yán)重影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法。其中柱層析法采用陰離子交換層析的原理，主要是利用帶負(fù)電荷的DNA在低離子強(qiáng)度的緩沖液中與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，洗去雜質(zhì)，然后再用高離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫下來(lái)。上述兩種純化方法以及其它回收DNA片段的方法，最終均要在有鹽的情況下進(jìn)行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有機(jī)分子與共沉淀的鹽。2、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素膜插片電泳法電泳洗脫法冷凍擠壓法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法試劑盒法（1）DEAE-纖維素膜插片電泳法DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負(fù)電荷的DNA分子。在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。500bp

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kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過(guò)10kb和單鏈DNA。(2)透析袋電洗脫一是將待回收的DNA片段電泳出凝膠介質(zhì)，使其進(jìn)入一個(gè)便于回收的小容積溶液中；二是分離純化出DNA片段。按是否使用透析袋可分為透析袋電泳洗脫法與非透析袋電泳洗脫法兩大類。（3）冷凍擠壓法將切下的含待回收DNA的凝膠塊置于液氮罐中快速冷凍、融化，然后擠壓，擠壓出的緩沖液中含有所需DNA。該法適于回收長(zhǎng)度小于5kb的DNA片段，快速、廉價(jià)，但回收率低。（4）低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法利用其純度高、熔點(diǎn)低（65℃）及凝固溫度低（30℃）的特點(diǎn)。切下含待回收DNA的凝膠，加熱到65℃熔化膠，然后抽提回收DNA。方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA。（5）試劑盒法硅基質(zhì)為填料的柱層析系統(tǒng)，DNA可與硅基質(zhì)可逆性結(jié)合。簡(jiǎn)便快速，回收率可達(dá)80%，適合于回收0.2~16kb的DNA片段。標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來(lái)。3、從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段該法能很好回收小于1kb的單鏈或者雙鏈DNA，且純度很高，無(wú)酶抑制劑，也無(wú)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。如果將切下的聚丙烯酰胺凝膠塊包埋于瓊脂糖凝膠中，再進(jìn)行DEAE纖維素膜插片法電泳或透析袋電泳洗脫，可以縮短雙鏈DNA的回收時(shí)間。RNA的分離與純化RNA中rRNA的數(shù)量最多，占總量的80%～85%；tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%～20%；mRNA僅占1%～5%。由于各種rRNA、tRNA及核內(nèi)小分子RNA的結(jié)構(gòu)與功能已比較清楚，從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā)，目前對(duì)RNA的分離與純化，主要集中在總RNA與mRNA上。（一）RNA制備的條件與環(huán)境為防止RNase對(duì)RNA的水解，一要全力避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性，二要盡快地抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。對(duì)廣泛存在的細(xì)胞外RNase，應(yīng)在RNA制備的全過(guò)程中保持高度的警惕，并采取嚴(yán)格的措施以避免其污染和抑制其活性。實(shí)驗(yàn)室保持潔凈戴手套和口罩盡量選用一次性材料及新包裝的化學(xué)試劑，嚴(yán)格洗滌、消毒處理玻璃器皿200℃干烤2hDEPC水處理冰浴選擇性地使用針對(duì)RNase的蛋白質(zhì)變性劑（如酚、氯仿等有機(jī)溶劑以及強(qiáng)烈的胍類變性劑）、蛋白酶K和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑（如SDS或脫氧膽酸鈉等）。由于高濃度胍類的使用，為防止SDS的沉淀，常改用十二烷基肌氨酸鈉。聯(lián)合使用RNase的特異性抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的水解。在變性液中加入β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以破壞RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。在RNA純化時(shí)，應(yīng)使用pH4.5～5.5的水飽和酚，酚與氯仿結(jié)合交替使用時(shí)去除蛋白的效果更好，而且氯仿還能有效抑制RNase的活性，通過(guò)使酚脫水防止mRNA的丟失，加速有機(jī)相與水相的分層，去除植物色素和蔗糖以及核酸樣品中的痕量酚。少量異戊醇的加入可消除抽提過(guò)程中因蛋白質(zhì)變性而產(chǎn)生的泡沫。對(duì)含量較低的樣品，加入糖原可以提高RNA的回收率既有利于DNA的變性又有利于RNA的分離。（二）總RNA的分離與純化總RNA提取法中最常使用的是一步法。目前常用的一步法均以異丙醇沉淀RNA，由于其選擇性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的總RNA中含有的小分子量RNA較少，rRNA和mRNA所占的比例相應(yīng)增高。目前的研究重點(diǎn)不是小分子量RNA，而是分子量較高的mRNA，不必苛求真正的總RNA。1、異硫氰酸胍-酚氯仿一步法經(jīng)典的一步法，由Chomczynski和Sacchi于1987年提出。以（異）硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉和-巰基乙醇為裂解液裂解細(xì)胞，pH在4.0的條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌。該法與以前的(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法相比，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，能同時(shí)迅速地處理多個(gè)標(biāo)本，且RNA的完整性與純度均很高。目前仍用于從培養(yǎng)細(xì)胞和大多數(shù)動(dòng)物組織中分離純化總RNA?？俁NA的產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每毫克組織總RNA的產(chǎn)量大約為4～7μg，每106個(gè)細(xì)胞大約為5～10μg。但該法不適合從富含甘油三酯的脂肪組織中提取RNA，而且有時(shí)RNA會(huì)帶有多糖和蛋白多糖的污染，這些污染將影響乙醇沉淀后RNA的溶解，同時(shí)抑制RT-PCR反應(yīng)，并通過(guò)結(jié)合到膜上而影響RNA雜交中的印跡步驟。脂肪組織RNA的提取可換用(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法。當(dāng)多糖與蛋白多糖的污染比較嚴(yán)重時(shí)，可通過(guò)增加一個(gè)有機(jī)溶劑的抽提步驟并改變RNA的沉淀?xiàng)l件而加以消除。2、商品化的單相裂解試劑法——改良方法以（異）硫氰酸胍-酚為裂解液，再加入氯仿形成兩相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相之間，上層是RNA溶液。最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌。3、其它方法RNA的分離純化方法與方案還有許多，如(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法、LiCl-尿素法、熱酚法等，因各種原因目前已較少使用。mRNA的分離真核生物的mRNA在細(xì)胞中含量少、種類多、分子量大小不一。除血紅蛋白及某些組蛋白外，絕大多數(shù)mRNA在其3'末端帶有一個(gè)長(zhǎng)短不一的poly(A)尾巴。以總RNA制品為起始材料，利用核酸的堿基配對(duì)原理，通過(guò)oligo(dT)-纖維素或poly(U)-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地同時(shí)分離不同種類與大小的mRNA的分子群體。理論上，它們可編碼細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白質(zhì)與多肽分子。1、oligo(dT)-纖維素層析柱法是mRNA制備的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法。它是以oligo(dT