稀土熒光探針檢測多巴胺及類似物

稀土熒光探針檢測

多巴胺及類似物答辯人：袁潔導(dǎo)師：趙美萍副教授2003年6月18日選題背景已有檢測方法綜述實驗部分總結(jié)致謝兒茶酚胺的結(jié)構(gòu)

及生理意義兒茶酚胺（catecholamine,CA）的種類、結(jié)構(gòu)和生理意義神經(jīng)遞質(zhì)在單細(xì)胞檢測中的意義Dopamine（DA）瑞典神經(jīng)藥理學(xué)家Carlsson于1958年首次提出腦內(nèi)多巴胺(DA)是獨立的神經(jīng)遞質(zhì)

正常值范圍為血漿：＜888pmol/L；尿：424-2612nmo1/24h。增高會引起嗜鉻細(xì)胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮癥酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低會引起植物神經(jīng)病變，帕金森病等。

Epinephrine（E）&

norepinephrine（NE）

在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：＜480pmo1/L；尿：0-80nmo1/24h在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：615-3240pmol/L；尿：0-590nmol/24h對兒茶酚胺的檢測手段

檢測方法靈敏度優(yōu)點缺點放射酶學(xué)法2.2×10-10

M,靈敏度高，選擇性好技術(shù)難度高，檢測速度慢，危險

HPLC法

depends分離效果好，可結(jié)合不同檢測器應(yīng)用流動相有可能影響檢測效果熒光測定法(THI、EDA)

10–10M-10–9M（改良后）常規(guī)使用，改良后靈敏度較高樣品處理程序復(fù)雜，特異性不高

電化學(xué)分析法

10–6M-10–5M能排除抗壞血酸的影響，重現(xiàn)性較好

靈敏度低,只是針對DA檢測,仍處于實驗研究階段

毛細(xì)管電泳（CE）法

10-8

M（depends）分離高效,耗樣量少

靈敏度尚不高稀土熒光探針法10-8

M簡便，可以與各種分離手段聯(lián)用靈敏度不夠高稀土熒光探針檢測

兒茶酚類化合物的原理單純的TbCl3，Tb-DCTA體系和DOPAC在實驗用的波長條件下(298nm,546.8nm)都沒有熒光信號，可見體系發(fā)光是由于形成了Tb-DCTA－DOPAC三重絡(luò)合物并發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移得結(jié)果。DOPAC的熒光圖紅：激發(fā)波長為279nm藍(lán)：激發(fā)波長為298nmTbCl3的熒光圖紅：激發(fā)波長為298nm藍(lán)：激發(fā)波長為240nmTb－DCTA熒光圖玫紅：激發(fā)波長為240nm綠：激發(fā)波長為240nm（三重絡(luò)合物，Tb－DCTA濃度同上）綠：激發(fā)波長為298nmTb－DCTA－DOPAC體系熒光圖綠：激發(fā)波長為240nm紅：激發(fā)波長為279nm藍(lán)：激發(fā)波長為298nm1.三元絡(luò)合物的形成三元絡(luò)合物體系：1.離子締合三元絡(luò)合物2.金屬離子先后結(jié)合兩種配體形成三元絡(luò)合物Tb－DCTA－CAs體系：Tb與DCTA先行絡(luò)合，然后Tb余下的空位再與CAs絡(luò)合，形成三重絡(luò)合體系

2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(1)配體受激后,單重態(tài)（S1）有三種方式退激：

a.產(chǎn)生熒光的輻射躍遷(S1-S0)b.系間竄躍(S1-T1)c.無輻射躍遷回基態(tài)(ISC)三重態(tài)（T1）也有三種退激方式：

a.產(chǎn)生磷光的輻射躍遷(T1-S0)b.通過無輻射轉(zhuǎn)移躍遷到Tb3＋的激發(fā)態(tài)(ET)，c.無輻射躍遷回基態(tài)(T1～S0)。2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(2)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)換效率的影響因素：1.配體最低的激發(fā)三重態(tài)（T1）能量高于Tb的5D4能級的能量2.能量轉(zhuǎn)移的速率大于三重態(tài)無輻射退激的速率3.從配體激發(fā)單重態(tài)向三重態(tài)系間竄躍的速率和幾率相當(dāng)高2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(3)兒茶酚胺的磷光發(fā)射波長在409

nm－417nm，亦即其三重態(tài)（T1）的能量高于Tb3＋的5D4能級約3800-4000cm－1高量子產(chǎn)率和躍遷幾率能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)高達(dá)1010s－1由水或解離的氧導(dǎo)致的配體三重態(tài)（T1）以及Tb3＋，發(fā)光的猝滅也大大減少了。實驗條件的優(yōu)化 稀土離子與第一配體的選擇：1.Eu3＋+EDTA體系；2.Eu3＋＋phen體系；

小結(jié)：最終棄用這兩個體系的原因，是其適用的pH范圍太低，難以使DA的羥基充分解離形成三元絡(luò)合物。實驗條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：

3.Tb3＋+EDTA體系（1）：

Tb:EDTA＝1:1（濃度均為2mmol/L）,

pH＝11,λex＝300nm，λem＝545nm,加入甲醇（分析純）、CsCl、TOPO等嘗試敏化,無法得到滿意檢測限，DA為10－5

mol/L小結(jié)：目前研究最多的體系，適用的pH相對于前兩個體系有了很大提高，但是仍然未能達(dá)到文獻(xiàn)報道的結(jié)果

實驗條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：

3.Tb3＋+EDTA體系（2）：

Tb:EDTA＝1:1（濃度均為2mmol/L）,pH＝11,λex＝240nm，λem＝545nm,出現(xiàn)遞減結(jié)果小結(jié)：在λex＝240nm，λem＝545nm,出現(xiàn)的Tb3＋特征波長處的遞減結(jié)果，可能是由于在檢測條件下,Tb－EDTA體系能發(fā)出Tb3＋的特征熒光，而待測物與之形成三重絡(luò)合體系后,激發(fā)波長紅移，亦即三重絡(luò)合體系的形成導(dǎo)致了一部分Tb3＋特征熒光的猝滅。A．CDOPAC－Fluro圖B．CDA-Fluro圖實驗條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：4.Tb3＋+DCTA體系：20oC時，Tb3＋與EDTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為17.93，而與DCTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為20.20*

因此本體系可以在更高pH下存在，更利于三重絡(luò)合物形成pH影響0.4mmol/LTb3＋－DCTA，2×10－5mol/LDOPAC，橫坐標(biāo)為pH0.2mmol/LTb3＋DCTA，4×10－5mol/LDOPAC溶液（色譜純甲醇：重蒸水＝9：1），橫坐標(biāo)為5ml樣品中10mol/LNaOH的體積表面活性劑的影響由于水分子對熒光有相當(dāng)?shù)拟缱饔?，體系又是在水相中，因此嘗試加入表面活性劑進(jìn)行改進(jìn)。期望熒光體系能夠被包裹在表面活性劑形成的膠束中得到保護(hù)，起到敏化作用。共嘗試加入了陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉，陽離子表面活性劑溴代十二烷基三甲胺和非離子表面活性劑TOPO。都未起到期望的對體系的改善作用。甲醇含量影響0.2

mmol/LTb3＋－DCTA，4×10－5mol/LDOPAC溶液，NaOHfixed重原子影響重原子對于熒光體系有時也可起到敏化作用。實驗嘗試向體系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入對體系的熒光有明顯得增強(qiáng)作用，最后選擇CsCl濃度為0.1mol/L。加樣順序影響Tb＋DCTA，甲醇，NaOH，CsClTb＋DCTA，甲醇，

CsCl，

NaOHTb＋DCTA，NaOH，甲醇，

CsClTb＋DCTA，NaOH，CsCl，甲醇Tb，DCTA，甲醇，NaOH，CsClDCTA，甲醇，Tb，NaOH，CsCl實驗操作向5ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1ml、10mol/LNaOH溶液0.04ml、10mol/LCsCl溶液0.05ml、色譜純甲醇4.5ml，混勻。在檢測前再加入待測物，用重蒸水定容至5ml，在激發(fā)波長為298nm，發(fā)射波長546.8nm處用0.5cm比色池測定熒光強(qiáng)度。實驗結(jié)果a.CDA－Fluro圖b.CDOPAC-Fluro圖

實驗結(jié)果c.C鄰二酚－Fluro圖d.C3，4－二羥基苯甲酸－Fluro圖實驗結(jié)果

被測物指標(biāo)多巴胺（DA）3,4－二羥基苯乙酸（DOPAC）鄰二酚（兒茶酚）3,4－二羥基苯甲酸線性范圍8×10－8－8×10－6mol/L8×10－8－8×10－6mol/L

8×10－8－8×10－6mol/L

8×10－8－8×10－6mol/L

線性相關(guān)系數(shù)0.99880.99920.99670.9982檢測限5.2×10－8mol/L3.6×10－8mol/L5.7×10－8mol/L2.97×10－8mol/L1.證明了CAs能夠與Tb和另一配