第八章色層分離

第八章

色層分離色層分離亦稱為色譜分離(ChromatographicResolution,CR)或?qū)游龇蛛x，在分析檢測中則常稱作為色譜分析(ChromatographicAnalysis,CA)。

它是一種物理的分離方法。當多組分混合物隨流動相流經(jīng)固定相時，由于各組分物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同的速度隨流動相移動，使之分離。色層分離系統(tǒng)固定相流動相1903年俄國植物學家茨維特用菊根粉研究植物色素的提取物，以石油醚作洗脫劑，得到分離的黃色、綠色區(qū)帶，故稱為色譜分離法。1931年又有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體，顯示了本法具有極高的分辯率。20世紀50年代：出現(xiàn)了氣相色譜。20世紀60年代：發(fā)展了高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)。20世紀80年代：開始在生物工業(yè)中應用，主要應用于高附加值產(chǎn)品，如胰鳥素、干擾素、生長激素、白細胞介素-2等。有兩次諾貝爾化學獎是授予色譜學領域的研究工作：1948年瑞典科學家Tiselins由于他的關于電泳和吸附分析的研究獲獎；1952年英國的Martin和Synge因為發(fā)展了分配色譜而獲獎。8.1色層分離基本概念8.2色層分離的基本原理8.3柱色層分離法8.4徑向色譜8.5親和色譜8.1色層分離基本概念8.1.1色層分離的特點8.1.2色層分離的分類8.1.3生物工業(yè)中的色層分離（1）分離效率高

色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)中最高的，每米柱長的理論塔板數(shù)可達幾千至幾十萬塊塔板數(shù)。如葡聚糖凝膠顆粒直徑為50~150μm，若每個理論塔板的高度相當于固定相兩個顆粒的距離，則每米柱長的理論塔板數(shù)為3,333~10,000塊。這種高效的分離尤其適合于極復雜混合物的分離，由于效率高，通常使用的色譜柱長一般只有幾厘米至幾十厘米。

8.1.1色層分離的特點（2）應用范圍廣——適合于各種原理從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子、無機到有機及生物活性物質(zhì)、以及熱穩(wěn)定到熱不穩(wěn)定的化合物，都可用色譜方法分離。（3）操作參數(shù)多——選擇性強不同的固定相和流動相狀態(tài)，固定相可用液、固兩大類，流動相可用氣體、液體或超臨界流體；不同的洗脫方法，如前沿分析、置換展開、洗脫展開等；不同的操作條件，如溫度、pH、離子強度和流動相速率等。

（4）高靈敏度的在線檢測——可保證在要求的純度下得到最高的產(chǎn)率。（5）快速分離

高效細顆粒層析劑和高壓液相色層分離技術(shù)的采用，保證了在高分離效率前提下的高分離速率。（6）過程自動化操作——計算機的應用使色譜分離過程自動化。

包括自動進樣、分離后的樣品餾份自動收集、未達到要求純度的餾份的再循環(huán)分離等。8.1.2色層分離的分類8.1.2.1按分離機理不同分類

（1）吸附色譜(AdsorptionChromatography,AC)指混合物隨流動相通過固定相時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。吸附作用可以是物理吸附作用，也可以是化學吸附作用，如范德華力、靜電力、共價結(jié)合力及氫鍵作用等。

吸附色譜包括無機基質(zhì)吸附色譜（含多種作用力）、疏水作用色譜（疏水鍵）、金屬螯合作用色譜、共價作用色譜、聚酰胺色譜（氫鍵作用力）等。（2）分配色譜(DistributionChromatography,DC)

又稱為液-液色譜，流動相和固定相是兩種互不相溶的液體，其中固定相是由液體涂漬到載體上形成的。分離原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。根據(jù)固定相和流動相的極性與非極性的差別，分配色譜又可分為正相色譜和反相色譜。正相色譜的固定相為極性，流動相為非極性；反相色譜則固定相為非極性，流動相為極性。（3）離子交換色譜（IonExchangeChromatography,IEC）

基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。離子交換色譜亦可歸類于吸附色譜。離子交換色譜包括多種分離原理：離子交換、吸附、吸收、穿透、擴散、離子親和力等。（4）凝膠色譜(GelChromatography,GC)

亦稱凝膠過濾，根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜(MolecularSieveChromatography,MSC)、空間排阻色譜或尺寸排阻色譜（SizeExclusionChromatography,SEC）。

凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)就如一個篩子。當混合物隨流動相流經(jīng)凝膠柱時，較大的分子不能進入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動相一起首先流出；較小的分子能進入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速率較慢；更小的分子能進入全部凝膠網(wǎng)孔，而最后從凝膠柱中流出。分子大小進入凝膠顆粒內(nèi)部孔隙狀況下移通道下移速度流出順序很小分子可進入全部孔隙最大最慢最后大分子不能進入所有的孔隙最?。▋H顆粒間空隙）最快最先中等分子可進入較大的孔隙中等中等中等（5）親和色譜(AffinityChromatography,AFC)

系利用生物分子間所具有的專一親和力而分離。把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相時，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。在實際操作中，不同的分離機理常可能同時存在。例如：在硅膠薄層色譜中，同時包含吸附作用和分配作用；在生物大分子的離子交換色譜分離中，有時會包含離子交換作用、吸附作用、分子篩作用和生物親和作用等機理。離子交換作用和親和作用亦可看作是特殊的吸附作用，因而也可把離子交換色譜和親和色譜歸類于吸附色譜。由此看來，上述分類僅具有相對意義。

8.1.2.2按固定相形狀不同分類（1）柱色譜分離各種不同機理的色譜分離都可在柱中進行。柱色譜分離具有進樣量大和回收容易等優(yōu)點。除用于分析外，還廣泛用于生物樣品的制備和工業(yè)生物產(chǎn)品的分離與純化。用作分析時，其分辨率不如紙上色譜和薄層色譜高。

（2）紙上色譜分離——以濾紙為載體的分配色譜

固定相——水相，濾紙纖維一般能吸附25~29%的水份。流動相——各種有機溶劑。紙上色譜分離具有設備簡單、操作方便、分離效率高、所需樣品量少等優(yōu)點，被廣泛用于定性與定量分析。但由于分離量少和回收困難，因而一般不用于制備和生產(chǎn)。（3）薄層色譜分離——將固定相在玻璃平板上鋪成薄層而進行分離的一種分離技術(shù)。

薄層色譜是柱色譜和紙上色譜二者的結(jié)合，兼有二者的優(yōu)點，如操作簡便、分離效率高、分離速率快和適合于不同分離機理的色譜分離等。薄層色譜分離法主要用于分析，如果增加薄層厚度（2~3mm），也可用于小量樣品的制備。

8.1.2.3其他分類方法

（1）根據(jù)流動相的物態(tài)不同，可分為氣相色譜分離、液相色譜分離和超臨界色譜分離。

（2）根據(jù)操作壓力不同，可分為低壓色譜分離（<0.5MPa）、中壓色譜分離(0.5~5MPa)和高壓色譜分離(5~50MPa)。（3）根據(jù)洗脫操作時展開方式的不同，可分為洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法三種。

8.1.3生物工業(yè)中的色層分離8.1.3.1色譜分離的規(guī)模（1）色譜分析：<10mg（2）半制備（或稱中等規(guī)模制備）：10～50mg（3）制備（或稱樣品制備）：0.1～10g（4）工業(yè)生產(chǎn)：>20g/day8.1.3.2色譜分離方法的選擇

選擇依據(jù)（1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學特性、及分子量的大小；（2）主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成份與含量；

（3）目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。

常用方法：（1）對于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子產(chǎn)品——多糖基質(zhì)（如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等）離子交換色譜、疏水作用色譜、凝膠色譜和親和色譜等。（2）氨基酸、有機酸、核苷酸等小分子離子型化合物——離子交換色譜分離。（3）抗生素、生物堿、萜類、色素等次生代謝產(chǎn)物——吸附色譜、反相分配色譜分離。

8.1.3.3分析色譜與工業(yè)(制備)色譜的比較

（1）應用色譜技術(shù)范圍的不同

分析色譜：流動相包括氣相和液相，固定相形狀包括柱、紙和薄板；制備和工業(yè)色譜：主要是以液相為流動相的柱上色譜。（2）操作上的不同

分析色譜：進樣量愈小愈好，檢測靈敏度越高越佳，大多用毛細管色譜柱；制備和工業(yè)色譜：進樣量愈多愈好，色譜柱較大，徑向色譜柱徑達20cm以上，以可分離和純化較多的產(chǎn)品。（3）色譜分離理論上的不同

理論塔板數(shù)與分離效果：對于生物大分子，色譜分離往往是多種分離機理的綜合效果，有時分離的好壞與理論塔板數(shù)無明顯的關系。分配系數(shù)的不同：*在分析分配色譜中，在一定溫度下，分配系數(shù)為常數(shù)，也即溶質(zhì)在兩相中的關系成線性關系，稱為線性色譜。*在制備和工業(yè)色譜中，樣品的濃度較高，分配系數(shù)既是溫度的函數(shù)，同時也是流動相溶質(zhì)濃度的函數(shù)，稱為非線性色譜。

樣品保留值與峰高的不同

*分析色譜：同一樣品的保留值是一個常數(shù)，因而可根據(jù)保留值的大小定性；色譜峰高與組分濃度呈線性關系，因而峰高可作為定量分析的指標。*制備和工業(yè)色譜：保留值不僅隨不同樣品而變，而且隨樣品的濃度而變，因而不能根據(jù)保留值定性。基于同樣的原因，色譜的峰高也不能作為制備和工業(yè)色譜定量分析的指標。8.2色層分離的基本原理8.2.1分配色譜

8.2.2吸附色譜（包括離子交換色譜和親和色譜）8.2.3凝膠色譜8.2.1分配色譜分配色譜是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離，其過程相當于連續(xù)性的溶劑萃取。適合于分配色譜的主要理論有：分配定律、阻滯因素（Rf值）、塔板理論等。8.2.1.1分配定律當一個被分離的混合物在流動相的攜帶下通過固定相時，溶質(zhì)在固定相和流動相之間的平衡關系服從分配定律：

*當溶質(zhì)濃度較低時，在一定溫度下Kd為常數(shù)，溶質(zhì)在兩相之間的分配成線性關系，其色譜過程稱為線性色譜；*當溶質(zhì)濃度較高時，Kd=f(Cm),與溶質(zhì)濃度有關，溶質(zhì)在兩相之間的分配成非線性關系，其色譜過程稱為非線性色譜。

8.2.1.2阻滯因數(shù)（Rf值）Rf值為柱中顆?？障堵屎头峙湎禂?shù)的函數(shù)：Rf值的范圍為：0≤Rf≤1（1）當Kd=0時，Rf=1，此種溶質(zhì)不溶于固定相，隨流動相以同樣的速率移動；（2）當Kd→∞時，Rf=0，此種溶質(zhì)不溶于流動相，而被分配在固定相中；（3）對于0<Rf<1的溶質(zhì)，Rf值越大，溶質(zhì)隨流動相移動的速率就越大，溶質(zhì)被洗脫的速率也就越快。

8.2.1.3塔板理論

同蒸餾操作一樣，色譜柱的分離效率也可用塔板理論來描述。所謂理論塔板高度是指這樣一段柱高，自這段柱中流出的液體（流動相）和其中固定相的平均濃度相平衡（一般為兩顆粒的距離）。

對于足夠柱長，第i塊塔板上溶質(zhì)的分數(shù)為：式中N為色譜柱的理論塔板數(shù)，E為分離因素。fi(i)為一正態(tài)分布曲線，當i=NE/(E+1)時，該塔板上的溶質(zhì)濃度最大，其最大值為：

隨著洗脫劑（溶劑）用量的增多，N值就越大，展開的時間就越長，其高峰濃度逐漸減少，色帶逐漸擴大。8.2.2吸附色譜

(離子交換色譜、親和色譜)8.2.2.1等溫曲線

吸附等溫曲線是指在一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系曲線。有許多不同的等溫曲線表達式，其中應用最廣的是Langmuir（蘭米爾）公式：（1）當溶質(zhì)濃度很低時，c值很小，1+bc≈1。于是：此時，吸附色譜同分配色譜一樣，均為線性色譜，常數(shù)a即為分配系數(shù)Kd（2）當溶質(zhì)濃度很高時，c值很大，1+bc≈bc。

于是：

此時，吸附劑上的所有溶質(zhì)結(jié)合位子都被溶質(zhì)所占滿，固定相中溶質(zhì)的濃度達最大值mt。

8.2.2.2解離常數(shù)與分離因數(shù)

在一定溫度下，分離物質(zhì)在液相和固相中的濃度關系可用吸附方程式來表示：

A+BA-Bkakdmcq令：c—溶質(zhì)在流動相中的濃度（即B的濃度）

q—溶質(zhì)在固定相中的濃度（即A-B的濃度）mt—吸附柱可結(jié)合溶質(zhì)分子的有效位子總濃度

m—吸附柱中空余的有效結(jié)合位子濃度ct—溶質(zhì)總濃度（游離的+被吸附的）

溶質(zhì)分子與吸附劑之間相互作用的解離常數(shù)為：

分離因數(shù)——指某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總量的分數(shù)，即：經(jīng)整理可得：

A+BA-Bkakdmcq≤1

（1）較高的有效結(jié)合位子濃度、較低的溶質(zhì)濃度和解離常數(shù)，具有較大的分離因數(shù)。

mt↑→α↑,ct↑→α↓，KP↑→α↓（2）當溶質(zhì)分子濃度ct相對于有效結(jié)合位子濃度mt很低時，即mt>>ct時，有：

此時，α與ct無關。（3）分離因數(shù)的范圍為0≤α≤1，當α=0時，此種溶質(zhì)不與固定相產(chǎn)生吸附作用，隨流動相以同樣的速率移動；當α=1時，該種溶質(zhì)分子都被吸附在固定相上，且不隨流動相往下移動。（4）在柱色譜分離中，有效的分離通常要求α值至少為0.8。對于親和層析劑，有效結(jié)合位子的總濃度mt在0.01mmol/L左右，若要使α值達到0.8以上，則Kp值應少于0.0025mmol/L。離子交換層析劑的mt值一般可達1mmol/L以上，其相應的Kp值應少于0.25mmol/L。（5）在柱色譜操作中，當流動相的體積達柱體積的1/（1-α）倍時，目的物質(zhì)將從柱的末端流出。由此可知，若目的物質(zhì)的分離因素α=0.8，色譜分離過程中希望目的物質(zhì)留在柱內(nèi)，則流動相體積與柱體積之比應少于5。

8.2.3凝膠色譜凝膠色譜分離具有許多特點：①凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好；②應用范圍廣，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的分子；③設備簡單，易于操作，周期短；④層析劑不需再生即可反復使用，有的可連續(xù)使用幾百次至上千次。

凝膠色譜柱的總體積分為三部分：

Vo—凝膠顆粒之間空隙的總體積（即外水體積）

Vi—凝膠顆粒內(nèi)部空隙總體積（即內(nèi)水體積）

Vm—凝膠顆?；|(zhì)本身所占體積。

洗脫容積——使溶質(zhì)從柱中流出時所通過的流動相體積：即：或式中，Kd為分配常數(shù)，表示某溶質(zhì)分子可以進入凝膠顆粒內(nèi)部空隙的分數(shù)。

（1）關于分配常數(shù)Kd當Kd=1時，意味著溶質(zhì)分子可以自由進入所有凝膠顆粒的微孔中，在洗脫過程中將最后流出色譜柱外；當Kd=0時，意味著溶質(zhì)分子完全被排阻于凝膠顆粒的微孔之外，而最先被洗脫。而對于中等分子，只有部分凝膠的空間能進入，其分配系數(shù)為0<Kd<1。其Kd值的大小就決定了物質(zhì)的流出順序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。在實際操作中，有時Kd>1，這表明除了凝膠的分子篩效應外，可能還存在吸附作用。（2）洗脫容積差設有兩種溶質(zhì)，其分配系數(shù)分別為Kd1和Kd2，兩者的洗脫容積差為：可見，欲將兩溶質(zhì)分子完全分離，試樣的體積應小于ΔVe。8.3柱色層分離法制備和工業(yè)規(guī)模的色譜分離大多采用柱色譜分離法，而紙上色譜和薄層色譜主要用于分析。吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜、離子交換色譜和親和色譜等都可在柱中進行。8.3.1層析劑8.3.2層析柱8.3.3洗脫操作8.3.1層析劑用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。

基質(zhì)：化學惰性物質(zhì)，與目的產(chǎn)物和雜質(zhì)都無結(jié)合作用；活性功能團：則根據(jù)所用色譜分離方法選用或者制取。

層析劑應具有的特性：（1）不溶于流動相，且具有較好的化學穩(wěn)定性和機械強度。（2）具有較大的表面積和孔隙度，且粒度、孔徑分布均勻。（3）有較高的回收率和負載量。（4）具有較好的熱穩(wěn)定性。（5）無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活。常用層析劑：無機基質(zhì)層析劑：硅膠、氧化鋁、活性炭、多孔玻璃、磷酸鈣等。有機基質(zhì)層析劑：瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇等。8.3.2層析柱一般情況下，柱的分離效率與柱長成正比，和柱的直徑成反比，因此色譜柱通常是細長的，一般地L/D=20～30。柱直徑大多為2～15cm。設計柱長時需考慮下列幾點：（1）柱的最小長度取決于所要達到的分離程度，目的產(chǎn)物的分離程度高，分辨率低，需要較長的色譜柱。（2）較大的柱直徑需要較長色譜柱。（3）柱越長，L/D比值越大，就越難得到均勻的填裝。就目前采用的勻漿填裝技術(shù)，填裝長度一般不能超過50cm。

8.3.3洗脫操作（展開操作）加入洗脫劑而使樣品中各組分分離的操作稱為展開。展開操作的方式有多種，在實際使用中選擇何種操作方式主要取決于：（1）樣品的性質(zhì)；（2）所需產(chǎn)品的純度：（3）要求的產(chǎn)率。下面將介紹幾種常用的展開方式。

8.3.3.1前沿分析法

——前沿分析法中，樣品連續(xù)不斷地輸入色譜柱，即樣品溶液本身起流動相的作用。AA+BA+B+C0溶質(zhì)總濃度流出液體積設混合液中，溶質(zhì)A、B、C與固定相的作用力為：C>B>A開始時，溶質(zhì)全部吸收在固定相內(nèi)，流出液為純?nèi)軇?；?jīng)一段時間洗脫后，與固定相作用力最弱的A物質(zhì)首先被洗出，出現(xiàn)第一個階梯；隨后作用力較強的B物質(zhì)和更強的C物質(zhì)也先后流出，形成第二個、第三個階梯，直至穩(wěn)定不變。前沿分析的特點（1）前沿分析法只能得到其中作用力最弱的純物質(zhì)，因而一般不用于混合物的分離。（2）適合于在產(chǎn)品的精制中除去痕量雜質(zhì)。（3）分離過程中樣品溶液本身就是流動相，其流出液中的組分濃度不變。AA+BA+B+C0溶質(zhì)總濃度流出液體積采用前沿分析法可測定樣品的吸附等溫曲線

設樣品溶液中只含有一種溶質(zhì)組分。開始時，溶質(zhì)被固定相所吸附，從柱中流出不含溶質(zhì)的純?nèi)軇硕螘r間所流出的純?nèi)軇┝糠Q為溶質(zhì)的保留容積Vr。當溶質(zhì)在固定相中達飽和狀態(tài)后，不再吸附溶質(zhì)，此時溶質(zhì)開始流出，且濃度與進料一樣。0溶質(zhì)濃度流出液體積CVr由Vr可計算出柱中固定相所吸附的溶質(zhì)濃度：

式中，c為樣品溶液中（流動相）溶質(zhì)的濃度，Vs為固定相的有效體積。在一定溫度下，改變流動相溶質(zhì)的濃度，測定其保留容積Vr，再計算出固定相所吸附的溶質(zhì)濃度q，即可繪制吸附等溫曲線。0溶質(zhì)濃度流出液體積CVr8.3.3.2置換展開法置換展開法又名頂替法或取代法。樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強的置換劑作為流動相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。在置換展開法中，最先從柱中被置換出來的是作用力最弱的溶質(zhì)，最后出來的是置換劑本身。0溶質(zhì)濃度流出液體積AB置換劑置換展開法特點：（1）各組分的濃度在展開過程中不但不會降低，有時甚至還能提高，即起到濃縮作用。（2）固定相的利用率較高。（3）各組分一個連一個流出，界限不甚分明，因而分離并不理想。（4）合適的置換劑不易找到。0溶質(zhì)濃度流出液體積AB置換劑8.3.3.3洗脫展開法

樣品輸入色譜柱后，隨即加入一種不與固定相發(fā)生作用的溶劑或幾種溶劑的混合物作為流動相沖洗。以流出液體積對溶質(zhì)濃度作圖，為由一系列的峰組成的曲線，每一個峰對應于一個組分，最先出現(xiàn)的峰是與固定相作用力最弱的溶質(zhì)，以后順次出現(xiàn)的峰其溶質(zhì)與固定相的作用力順次增加。0溶質(zhì)濃度流出液體積AB洗脫展開法特點：（1）峰的面積與溶質(zhì)含量成正比，由此可作定量分析。（2）組分的保留容積為開