分子遺傳學(xué)復(fù)制詳解演示文稿

分子遺傳學(xué)復(fù)制詳解演示文稿第一頁(yè)，共六十頁(yè)。優(yōu)選分子遺傳學(xué)復(fù)制第二頁(yè)，共六十頁(yè)。雙螺旋模型的提出，預(yù)示了DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。對(duì)于DNA復(fù)制，必須了解其起始、過(guò)程、終止、酶學(xué)、類型和單位。第三頁(yè)，共六十頁(yè)。第一節(jié)復(fù)制原點(diǎn)、方向、方式和基本單位第四頁(yè)，共六十頁(yè)。一、復(fù)制原點(diǎn)

DNA復(fù)制必須在特定的位置開始，這樣的位置稱為復(fù)制原點(diǎn)。大腸桿菌只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)（oriC），它包含4個(gè)dnaA盒：dnaA蛋白結(jié)合的位點(diǎn)1個(gè)富含A/T區(qū)：呼吸作用強(qiáng)烈的區(qū)段真核生物染色體具有許多復(fù)制原點(diǎn)，它們都有一個(gè)富含A-T的自動(dòng)復(fù)制序列（ARS）元件，其共有序列為：(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。被原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體（ORC）所識(shí)別。第五頁(yè)，共六十頁(yè)。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)序列第六頁(yè)，共六十頁(yè)。二、復(fù)制方向

DNA復(fù)制的方向是指復(fù)制叉移動(dòng)的方向。復(fù)制叉復(fù)制眼復(fù)制方向有3種方式：雙向復(fù)制（多數(shù)情況）單向復(fù)制不對(duì)稱雙向復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)環(huán)狀DNA雙向復(fù)制形成的結(jié)構(gòu)第七頁(yè)，共六十頁(yè)。大腸桿菌DNA復(fù)制的電鏡照片電鏡照片的模式圖第八頁(yè)，共六十頁(yè)。對(duì)于環(huán)狀DNA，不論是雙向復(fù)制，還是單向復(fù)制，都會(huì)形成結(jié)構(gòu)?？梢杂梅派湫詷?biāo)記法來(lái)觀察鑒別復(fù)制方向：雙向復(fù)制：兩個(gè)復(fù)制叉都有放射活性單向復(fù)制：僅一個(gè)復(fù)制叉有放射活性雙向復(fù)制一般等速進(jìn)行，最終兩個(gè)復(fù)制叉在與原點(diǎn)相對(duì)的位置相遇而使復(fù)制結(jié)束。單向復(fù)制的終點(diǎn)就是復(fù)制原點(diǎn)。第九頁(yè)，共六十頁(yè)。大腸桿菌有促使復(fù)制終止的序列，稱為ter位點(diǎn)，長(zhǎng)度約23bp。已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)終止區(qū)，位于交匯點(diǎn)兩側(cè)約100bp處。第十頁(yè)，共六十頁(yè)。在雙向復(fù)制中，當(dāng)兩個(gè)復(fù)制叉因故不等速時(shí)，ter位點(diǎn)會(huì)迫使較快的復(fù)制叉停頓下來(lái)，等待較慢的復(fù)制叉，從而保證復(fù)制在終止區(qū)內(nèi)結(jié)束。每條單鏈的ter位點(diǎn)都結(jié)合上ter結(jié)合蛋白，從而阻止復(fù)制叉的通過(guò)。第十一頁(yè)，共六十頁(yè)。大腸桿菌DNA復(fù)制的整個(gè)過(guò)程第十二頁(yè)，共六十頁(yè)。真核生物的復(fù)制都是雙向的，且沒有固定的復(fù)制終點(diǎn)。第十三頁(yè)，共六十頁(yè)。通常復(fù)制原點(diǎn)是位于兩條鏈的同一處，因而兩條鏈的復(fù)制是對(duì)稱的。但哺乳動(dòng)物線粒體DNA的兩條鏈的復(fù)制原點(diǎn)的位置不同，因而兩條鏈復(fù)制起始的位置和時(shí)間不同，造成不對(duì)稱雙向復(fù)制。重鏈（H）輕鏈（L）重鏈復(fù)制原點(diǎn)輕鏈復(fù)制原點(diǎn)取代環(huán)（D環(huán)）第十四頁(yè)，共六十頁(yè)。第十五頁(yè)，共六十頁(yè)。第十六頁(yè)，共六十頁(yè)。三、復(fù)制方式

DNA復(fù)制有兩種方式：

復(fù)制叉式復(fù)制：即在復(fù)制原點(diǎn)形成復(fù)制叉，其新鏈合成所需的引物是新合成的，故稱為從新開始。這是最常見的復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制：環(huán)狀DNA采取的一種復(fù)制方式。其新鏈合成無(wú)須合成引物，而是利用一條親鏈切斷后產(chǎn)生的3端，由此不斷延伸，合成出新鏈，故稱為共價(jià)延伸。新合成的鏈不斷從環(huán)中甩出，樣子猶如滾環(huán)。第十七頁(yè)，共六十頁(yè)。復(fù)制原點(diǎn)因負(fù)超螺旋而松纏，形成單鏈區(qū)，A蛋白切斷正鏈，并結(jié)合到5端上。以自由3端為引物，以負(fù)鏈為模板合成新鏈，并將正鏈置換出來(lái)。復(fù)制叉回到復(fù)制原點(diǎn)后，A蛋白切斷正鏈，結(jié)合到新的5端上，開始新一輪復(fù)制，釋放出的正鏈可作為模板合成負(fù)鏈。噬菌體X174的復(fù)制模式第十八頁(yè)，共六十頁(yè)。第十九頁(yè)，共六十頁(yè)。

許多噬菌體都采用滾環(huán)式復(fù)制。某些真核生物的卵母細(xì)胞中采用滾環(huán)式復(fù)制來(lái)擴(kuò)增rDNA（即rRNA基因），以滿足大量合成蛋白質(zhì)的需要。rDNA的每個(gè)重復(fù)單位先形成環(huán)狀DNA，然后開始復(fù)制。第二十頁(yè)，共六十頁(yè)。四、復(fù)制單位

DNA復(fù)制是以復(fù)制子（replicon）為單位進(jìn)行的。每個(gè)復(fù)制子應(yīng)包含一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，還可能包含一個(gè)復(fù)制終點(diǎn)。在每個(gè)細(xì)胞周期中，一個(gè)復(fù)制子只能被激活一次。一個(gè)原核生物的基因組就是一個(gè)復(fù)制子。每條真核生物的染色體包含許多復(fù)制子，相鄰復(fù)制原點(diǎn)間的平均距離就是復(fù)制子的平均長(zhǎng)度。真核生物的復(fù)制子較短，且復(fù)制速度較慢。第二十一頁(yè)，共六十頁(yè)。幾種生物復(fù)制子的數(shù)量、長(zhǎng)度、復(fù)制速度第二十二頁(yè)，共六十頁(yè)。第二節(jié)DNA復(fù)制有關(guān)的酶第二十三頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA復(fù)制主要涉及到5種酶DNA聚合酶DNA連接酶解旋酶（螺旋酶）旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶II）引發(fā)酶第二十四頁(yè)，共六十頁(yè)。一、DNA聚合酶

指能夠利用DNA模板合成DNA新鏈的酶，其中只有某些負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制，又特稱為復(fù)制酶。大腸桿菌中有3種DNA聚合酶，分別記為polI、polII和polIII，其中polI和polII主要在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用，polIII才是復(fù)制酶。第二十五頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：(1)模板結(jié)合位點(diǎn)；(2)引物結(jié)合位點(diǎn)；(3)引物3‘－OH結(jié)合位點(diǎn)；(4)底物dNTP結(jié)合位點(diǎn)；(5)5‘→3’外切酶結(jié)合位點(diǎn)；(6)3'→5'校正位點(diǎn)。

第二十六頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA聚合酶以dNTP（N=A、T、G、C）為底物，根據(jù)模板鏈和堿基配對(duì)規(guī)則，催化正確的核苷酸的5位與正在合成的鏈的3端產(chǎn)生磷酸二酯鍵。第二十七頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA聚合酶催化DNA的合成必須提供3位的自由OH基，亦即需要一個(gè)引物。DNA聚合酶催化DNA的合成（亦即新鏈的延伸）只能朝53的方向。第二十八頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA聚合酶除了聚合功能外，還具有35外切酶活性。第二十九頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA聚合酶具有一種校對(duì)功能。考慮堿基配對(duì)互作，錯(cuò)配率預(yù)期為10-3，而細(xì)菌中實(shí)際為10-8~10-10。這主要?dú)w功于校對(duì)功能。第三十頁(yè)，共六十頁(yè)。polI有很強(qiáng)的缺口（即DNA單鏈區(qū)）填補(bǔ)功能，可以對(duì)因DNA復(fù)制或損傷產(chǎn)生的缺口進(jìn)行填補(bǔ)，但最后會(huì)留下一個(gè)切刻（即填補(bǔ)的最后一個(gè)核苷酸的3位的OH不能與其后面原來(lái)存在的核苷酸的5位的磷酸根產(chǎn)生酯鍵）。

polI（又稱Klenow）還具有內(nèi)切酶和53外切酶活性，能產(chǎn)生切刻平移。該功能可用來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。第三十一頁(yè)，共六十頁(yè)。第三十二頁(yè)，共六十頁(yè)。哺乳動(dòng)物中名稱與細(xì)菌的類比polIpolIIIpolII細(xì)胞中位置細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體功能復(fù)制修復(fù)復(fù)制修復(fù)復(fù)制真核生物中的DNA聚合酶第三十三頁(yè)，共六十頁(yè)。二、其它有關(guān)的酶

名稱功能DNA連接酶共價(jià)連接切刻（產(chǎn)生磷酸二酯鍵），將兩條不連續(xù)的單鏈連成整體。解旋酶解開雙鏈，使復(fù)制叉向前移動(dòng)。旋轉(zhuǎn)酶產(chǎn)生負(fù)超螺旋，使雙鏈松纏，并消除復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物。第三十四頁(yè)，共六十頁(yè)。第三節(jié)復(fù)制起始和過(guò)程第三十五頁(yè)，共六十頁(yè)。一、復(fù)制起始

以大腸桿菌為例第一步：在HU和IHF蛋白的協(xié)助下，DnaA蛋白與復(fù)制原點(diǎn)上的4個(gè)dnaA盒結(jié)合，使富含A/T區(qū)解開，暴露出兩條單鏈。第三十六頁(yè)，共六十頁(yè)。第二步：在DnaA和DnaC蛋白的輔助下，DnaB蛋白（解旋酶）進(jìn)入單鏈區(qū)，并按53方向移動(dòng)。第三十七頁(yè)，共六十頁(yè)。第三步：隨著解旋酶的移動(dòng)，單鏈區(qū)逐漸擴(kuò)大，引發(fā)酶和單鏈結(jié)合蛋白（SSB）遂與單鏈結(jié)合，這標(biāo)志著復(fù)制已經(jīng)啟動(dòng)。第三十八頁(yè)，共六十頁(yè)。第三十九頁(yè)，共六十頁(yè)。二、復(fù)制過(guò)程

解旋酶打破氫鍵，在復(fù)制叉處解開雙鏈，SSB隨之結(jié)合到親本單鏈上，防止單鏈恢復(fù)成雙鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶（旋轉(zhuǎn)酶）位于解旋酶前方，消除由雙鏈解開而造成的正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物，polIII隨之合成新鏈。

polI切除RNA引物，并將缺口填上。DNA連接酶將新合成的DNA鏈片段共價(jià)連接起來(lái)。注意：先導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而后隨鏈則需在暴露出一定長(zhǎng)度的單鏈后沿相反方向合成，因而是間斷的。因此DNA合成是半連續(xù)的。第四十頁(yè)，共六十頁(yè)。DNA復(fù)制過(guò)程圖解第四十一頁(yè)，共六十頁(yè)。第四節(jié)線形DNA末端的復(fù)制問(wèn)題第四十二頁(yè)，共六十頁(yè)。由于所有的DNA聚合酶都只能催化53方向的合成，因而造成線形DNA末端的復(fù)制問(wèn)題。第四十三頁(yè)，共六十頁(yè)。第四十四頁(yè)，共六十頁(yè)。不同的生物有不同的解決辦法：

辦法一：將線形DNA環(huán)化。如：噬菌體。

辦法二：幾個(gè)線形DNA分子首尾連接形成多聚體（連環(huán)）分子。如：T7噬菌體。辦法三：利用特殊的蛋白質(zhì)從末端終止位點(diǎn)起始復(fù)制。如：腺病毒，噬菌體29。辦法四：利用可變末端。如：真核生物中的端粒結(jié)構(gòu)。第四十五頁(yè)，共六十頁(yè)。末端蛋白大小為55kD，它通過(guò)絲氨酸殘基與DNA5端上的自由磷酸根共價(jià)結(jié)合第四十六頁(yè)，共六十頁(yè)。末端蛋白還能與DNA聚合酶結(jié)合，并攜帶一個(gè)胞嘧啶作為復(fù)制起始的引物第四十七頁(yè)，共六十頁(yè)。腺病毒依賴一種末端蛋白可以從平頭末端開始復(fù)制先對(duì)一條鏈進(jìn)行復(fù)制，新鏈取代舊鏈?zhǔn)怪尫懦鰜?lái)。被取代出來(lái)的單鏈兩末端具有互補(bǔ)性，可以自配對(duì)形成雙鏈末端，于是復(fù)制可以啟動(dòng)。第四十八頁(yè)，共六十頁(yè)。真核染色體的端粒是一段由很短的重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，并存在一個(gè)單鏈的3末端。第四十九頁(yè)，共六十頁(yè)。不同生物的端粒序列有一定的差異第五十頁(yè)，共六十頁(yè)。端粒的總體長(zhǎng)度是受遺傳控制的。DNA復(fù)制時(shí)，端粒序列會(huì)縮短，但通過(guò)端粒酶，可以使端粒伸長(zhǎng)，從而達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡。端粒酶是一種核酸蛋白復(fù)合體，含有RNA，可以作為合成端粒一條鏈的模板。因此，端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶。第五十一頁(yè)，共六十頁(yè)。四膜蟲端粒的合成第五十二頁(yè)，共六十頁(yè)。第五十三頁(yè)，共六十頁(yè)。第五十四頁(yè)，共六十頁(yè)。第五節(jié)真核生物核小體的復(fù)制第五十五頁(yè)，共六十頁(yè)。復(fù)制中雙鏈解開時(shí)，核小體即解體。但雙鏈一旦合成，即組裝新的核小體。新核小體中的組蛋白是隨機(jī)組裝的，既包含舊的，也包含新合成的。第五十六頁(yè)，共六十頁(yè)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)先將細(xì)胞培養(yǎng)在含重氨基酸的條件下產(chǎn)生重組蛋白。然后將細(xì)胞培養(yǎng)在含輕氨基酸的條件下進(jìn)行DNA復(fù)制。培養(yǎng)一段時(shí)間后，提取核小體八聚體，進(jìn)行梯度離心，預(yù)計(jì)可能有兩種結(jié)果：結(jié)果一：如果核小體不是重新組裝的，則將出現(xiàn)兩個(gè)分離的帶區(qū)，重的（下面）帶區(qū)為舊的核小體，輕的（上面）帶區(qū)為新的核小體。結(jié)果二：如果核小體是重新組裝的，則出現(xiàn)一個(gè)寬的連續(xù)變化的帶區(qū)，中間部分