第四章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥演示文稿

第四章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥演示文稿第一頁，共七十五頁。優(yōu)選第四章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第二頁，共七十五頁。1665年RobertHook發(fā)現(xiàn)軟木塞中蜂窩狀小室（cell）1667年荷蘭科學(xué)家Leeuwenhoek觀察到真正的活細(xì)胞1838～1839年德國植物學(xué)家Schleiden和動(dòng)物學(xué)家Schwann提出細(xì)胞學(xué)說第三頁，共七十五頁?！凹?xì)胞學(xué)說”的基本內(nèi)容有機(jī)體是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所構(gòu)成的，細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的基本單位。每個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的單位，既有它“自己的”生命,又對(duì)與其它細(xì)胞共同組成的整體的生命有所助益。新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。第四頁，共七十五頁。組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)是將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，在體外模擬機(jī)體體內(nèi)生理?xiàng)l件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對(duì)人類有用的產(chǎn)品。第五頁，共七十五頁。細(xì)胞工程包括：真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)；細(xì)胞融合的理論和技術(shù)；細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)；染色體改造的理論和技術(shù)；轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的理論和技術(shù)；細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)；將有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)。第六頁，共七十五頁。表1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物

疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等

動(dòng)物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、豬霍亂疫苗、狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑β-細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素等酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等第七頁，共七十五頁。第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特征

一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)1、動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核第八頁，共七十五頁。2、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生長特性貼壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞懸浮細(xì)胞如血液白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等兼性貼壁細(xì)胞

如中國倉鼠卵巢細(xì)胞第九頁，共七十五頁。二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝1、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成細(xì)胞中具有24種元素：對(duì)生命起著特別重要的作用——C、H、O、N、P、S細(xì)胞中少，但是必需的——Ca、K、Na、Cl、Mg、Fe其它——Mn、I、Mo、Co、Zn、Se、Cu、Cr、Sn、V、Si、F微量元素第十頁，共七十五頁。細(xì)胞中的化合物分為：無機(jī)物：如水、無機(jī)鹽有機(jī)物：如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類第十一頁，共七十五頁。三個(gè)階段（書P83頁圖）第一階段：大分子降解為小分子。多糖——單糖；脂肪——甘油、脂肪酸；蛋白質(zhì)——氨基酸第二階段：小分子代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A、α–酮戊二酸、草酰乙酸第三階段：三個(gè)中間產(chǎn)物進(jìn)入“三羧酸循環(huán)”，產(chǎn)生生命活動(dòng)必需的能量2、動(dòng)物細(xì)胞的代謝第十二頁，共七十五頁。1、細(xì)胞的分裂周期長G1期：合成DNA聚合酶和RNA，為DNA合成做準(zhǔn)備。S期：DNA合成G2期：DNA量加倍，RNA合成，染色體螺旋化。M期：0.5-1h，分裂形成子細(xì)胞。細(xì)胞分裂周期圖三、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)第十三頁，共七十五頁。2、細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。

接觸抑制：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與周圍細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。若細(xì)胞轉(zhuǎn)化成異倍體后，該抑制可解除第十四頁，共七十五頁。腫瘤細(xì)胞在生長過程中喪失接觸抑制第十五頁，共七十五頁。細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)有限細(xì)胞系無限細(xì)胞系多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。遺傳物質(zhì)改變3、正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的。

第十六頁，共七十五頁。4、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感物理化學(xué)因素，如滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化都會(huì)影響其生長，這是由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，所以更敏感。5、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求很高原核生物：只要有碳源、氮源和無機(jī)鹽就可以生長動(dòng)物細(xì)胞：12種必需氨基酸、8種以上維生素、多種無機(jī)鹽和微量元素、葡萄糖、多種細(xì)胞生長因子和貼壁因子。第十七頁，共七十五頁。6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同

原核生物動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成游離的核糖體：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：糖基化及一系列翻譯后修飾無粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，因此沒有糖基化及一系列翻譯后修飾。第十八頁，共七十五頁。四、每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）第十九頁，共七十五頁。游離期：

細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。貼壁期：

細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘——4小時(shí)貼壁。

底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等

進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)第二十頁，共七十五頁。潛伏期

此時(shí)細(xì)胞有生長活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期：

細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：

細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制第二十一頁，共七十五頁。第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得

一、要求原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞50代以內(nèi)異倍體細(xì)胞無限傳代第二十二頁，共七十五頁。二、獲得1、原代細(xì)胞細(xì)胞原代培養(yǎng)過程第二十三頁，共七十五頁。2、二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。特點(diǎn)：（1）二倍體；（2）有明顯的貼壁和接觸抑制特性；（3）有限的增殖能力；（4）無致瘤性。第二十四頁，共七十五頁。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。自發(fā)的轉(zhuǎn)化：在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細(xì)胞人為的轉(zhuǎn)化：采用某些試劑處理，或從動(dòng)物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系第二十五頁，共七十五頁。優(yōu)點(diǎn)：（1）無限傳代；（2）倍增時(shí)間短；（3）對(duì)培養(yǎng)條件和生長因子的要求低；（4）適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。第二十六頁，共七十五頁。4、融合細(xì)胞系細(xì)胞融合是指通過兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程。（1）概念第二十七頁，共七十五頁。（2）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展簡史：19世紀(jì)30年代——病理組織中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞19世紀(jì)70年代——蛙血細(xì)胞多核細(xì)胞1958年——滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功后來——誘導(dǎo)了不同種動(dòng)物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成活第二十八頁，共七十五頁。a.仙臺(tái)病毒融合法（3）細(xì)胞融合的方法：第二十九頁，共七十五頁。b.聚乙二醇融合法主要用于單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。第三十頁，共七十五頁。c.電融合法利用細(xì)胞在短時(shí)間的強(qiáng)電場作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿，而使相鄰的細(xì)胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合.操作簡便無化學(xué)毒性對(duì)細(xì)胞損傷小融合同步，融合率高可在顯微鏡下直接觀察優(yōu)點(diǎn)：5、重組工程細(xì)胞系采用基因工程方法構(gòu)建工程細(xì)胞第三十一頁，共七十五頁。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性BHK21：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。舉例：CHO-K1（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌。第三十二頁，共七十五頁。MRC-5(人胎肺成纖維細(xì)胞)：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命42-46代，用于制備疫苗。WI38：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時(shí)間為24小時(shí)，有限壽命50代，用于制備疫苗。第三十三頁，共七十五頁。四、細(xì)胞庫的建立用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞建立：生產(chǎn)所需的細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)胞庫（MWCB）原始細(xì)胞庫（MCB）第三十四頁，共七十五頁。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基

1、所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對(duì)無菌，避免污染；2、必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對(duì)不可有有害的物質(zhì)，避免有害離子；3、保證有適量的氧氣供應(yīng)；4、需隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物；5、有良好的適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度；6、及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度。動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需基本條件第三十五頁，共七十五頁。玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、滴管等浸泡（自來水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、沖水、烘干、酸泡（12小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、三蒸水沖洗，50℃烘干塑料器皿：培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等。自來水沖洗、洗衣粉超聲波清洗、沖水、晾干、酸泡（12小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、雙蒸水沖洗，晾干一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件1.器材的清洗和消毒（1）器材的清洗第三十六頁，共七十五頁。（2）器材的消毒滅菌干熱消毒

電熱干燥箱:160℃，60-120min,用于玻璃器皿的消毒第三十七頁，共七十五頁。b.濕熱消毒

高壓蒸汽滅菌器:

用于布類、金屬器材、玻璃器皿、液體、橡膠物品的消毒。第三十八頁，共七十五頁。c.紫外線消毒

紫外燈：主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒缺點(diǎn):產(chǎn)生臭氧，影響身體健康。d.過濾除菌消毒

濾器：用于大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。

第三十九頁，共七十五頁。濾器正壓不銹鋼過濾裝置示意圖

第四十頁，共七十五頁。e.消毒劑和抗生素

消毒劑：75%酒精、過氧乙酸、新潔爾滅用于操作人員的皮膚、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、器械、器皿的操作表面、實(shí)驗(yàn)室的椅、桌、墻、地面等的消毒。

抗生素：青霉素、鏈霉素等用于預(yù)防培養(yǎng)用液的染菌第四十一頁，共七十五頁。

超凈工作臺(tái)的工作原理：利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境第四十二頁，共七十五頁。自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否有毒元素、金屬離子、微生物污染。2.水質(zhì)第四十三頁，共七十五頁。pH7.2~7.4，最適pH<6.8或>7.6，不利于細(xì)胞的生長3.pHpH的高低對(duì)細(xì)胞各種酶的活性，細(xì)胞的通透性、及許多蛋白的功能有重要影響。水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否pH緩沖系統(tǒng)：如Na2HPO4/NaH2PO4緩沖系統(tǒng)pH緩沖劑：HEPES第四十四頁，共七十五頁。4.滲透壓使用平衡鹽溶液（BSS）保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。成分主要為：無機(jī)鹽和葡萄糖，如Hanks平衡鹽。5.溫度動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：37℃昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：27℃第四十五頁，共七十五頁。6.空氣

氧氣：采用培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)，不需專門通氣

采用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)生產(chǎn)，要專門通氣

CO2：細(xì)胞生長需要，又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物。與維持培養(yǎng)基的pH有關(guān)。第四十六頁，共七十五頁。CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：

①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。③箱內(nèi)蒸餾水槽中加入滅菌蒸餾水3000ml以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱第四十七頁，共七十五頁。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成1.天然培養(yǎng)基生物性液體（如血清）組織浸液（如胚胎浸液）凝固劑（如血漿）2.合成培養(yǎng)基BME,MEM,DMEM,HAMF12,RPMI1640等產(chǎn)品第四十八頁，共七十五頁。合成培養(yǎng)基的成分（1）氨基酸細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料至少含12種必需氨基酸+谷氨酰胺（2）維生素維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶如維生素A、維生素D、維生素B2等。（3）糖類

碳源，如葡萄糖。第四十九頁，共七十五頁。（4）無機(jī)鹽

保持細(xì)胞的滲透壓并，緩沖pH的變化，并參與代謝。如NaCl,KCl,MgSO4,Na2HPO4等。（5）其他成分

核酸前體，如腺苷、鳥苷等。氧化還原劑，如谷胱甘肽等。動(dòng)物血清，如小牛血清、胎牛血清。第五十頁，共七十五頁。添加小牛血清的作用：1、提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的各種生長因子和激素；

如，胰島素、表皮生長因子等；皮質(zhì)醇、雌二醇等。2、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子；如，纖維結(jié)合蛋白、膠原等。3、提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；如，白蛋白等。4、提供細(xì)胞生長所必需的脂肪酸和微量元素。如，膽固醇、前列腺素E等。銅、鋅、硒等。第五十一頁，共七十五頁。3.無血清培養(yǎng)基提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細(xì)胞差異；減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；*減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。優(yōu)點(diǎn)：合成培養(yǎng)基+

激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素第五十二頁，共七十五頁。第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、細(xì)胞分離離心分離法從含有細(xì)胞的體液中分離細(xì)胞。如血液、羊水、腹水等。800~1000r/min,5~10min2.消化分離法生物體——組織塊——剪碎——消化——終止消化——200目濾網(wǎng)過濾——單細(xì)胞懸液第五十三頁，共七十五頁。常用的幾種消化液：（1）1%胰蛋白酶溶液（2）0.02%EDTA溶液（3）胰酶-檸檬酸鹽（4）胰酶-EDTA溶液第五十四頁，共七十五頁。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)1.自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)：Coulter計(jì)數(shù)儀2.血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：區(qū)分死活細(xì)胞：臺(tái)盼藍(lán)染色、苯胺黑染色計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×1×104

×稀釋倍數(shù)公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3第五十五頁，共七十五頁。3.結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法：細(xì)胞分散解離、破碎，細(xì)胞核藍(lán)色。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。4.MTT染色計(jì)數(shù)法：細(xì)胞存活率檢測四甲基偶唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。

MTT比色法的原理：活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能將MTT還原成不溶干水的紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的紫色結(jié)晶量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值。

第五十六頁，共七十五頁。

操作步驟:（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）（2）加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時(shí)。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長490nm）。培養(yǎng)板孔板振蕩器酶標(biāo)儀第五十七頁，共七十五頁。根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種1.懸浮生長細(xì)胞傳代加入培養(yǎng)液，分瓶培養(yǎng)。2.半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3.貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。三、細(xì)胞傳代第五十八頁，共七十五頁。貼壁生長細(xì)胞傳代方法：吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測）。吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。吸取細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，1傳2或1傳3。加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第五十九頁，共七十五頁。細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。四、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇第六十頁，共七十五頁。1、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第六十一頁，共七十五頁。（1）慢凍程序：程序降溫盒：1℃/min降溫4℃-20℃-80℃液氮（2）低溫保護(hù)劑的應(yīng)用：2、細(xì)胞的凍存在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。第六十二頁，共七十五頁。（3）細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：含血清培養(yǎng)基，10%DMSO。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液。加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。第六十三頁，共七十五頁。從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，搖動(dòng)使其融化（1分鐘左右）。用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。低速離心5分鐘。去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。隔天觀察細(xì)胞生長情況，并換液。3、細(xì)胞的復(fù)蘇第六十四頁，共七十五頁。第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法

和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法實(shí)際生產(chǎn)可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁懸浮培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。缺點(diǎn)：由于細(xì)胞體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。*第六十五頁，共七十五頁。2、貼壁培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達(dá)到高密度細(xì)胞。缺點(diǎn)：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。第六十六頁，共七十五頁。3、貼壁-懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)將對(duì)細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：1、可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積，2、載體體積較小，比重較輕，輕度攪拌即可攜帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。第六十七頁，共七十五頁。微載體的條件１.表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性２.微載體的材料無毒性３.微載體的材料是惰性的４.微載體的比重在1.030～1.045g/ml５.粒徑在60～250μm之間，且均一６.具良好的光學(xué)透明性