簡(jiǎn)述核酸疫苗制備過(guò)程

簡(jiǎn)述核酸疫苗制備過(guò)程核酸疫苗又稱基因疫苗，是指將編碼某種抗原蛋白的外源直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)并合成抗原蛋白，并激起機(jī)體一系列類似于疫苗接種的免疫應(yīng)答；起到預(yù)防和治療疾病的目的。自1990年Wolff等人意外發(fā)現(xiàn)核酸疫苗后，其相關(guān)的研究得到了廣泛的重視，并得以迅速發(fā)展，譽(yù)為“第三次疫苗革命”。本文就核酸疫苗的構(gòu)建、特性、免疫機(jī)制、接種方式、影響因素、研究現(xiàn)狀和前最作一綜述。一核酸疫苗的構(gòu)建核酸疫苗是由編碼病原體抗原的基因和作為真核細(xì)胞表達(dá)裁體的質(zhì)粒DNA組成。病原體抗原的編碼基因可以是一組相關(guān)基因或單一病原體免疫保護(hù)性抗原基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段DNA序列，其表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)是病原體的有效成分，可以引發(fā)保護(hù)性免疫。用于構(gòu)建核酸疫苗的載體質(zhì)粒多以pUC或pBR322質(zhì)粒為基本骨架，主要包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和3'端多聚A。巨細(xì)胞病毒(CMV〉啟動(dòng)子和ROUS肉瘤病毒(RSV)的啟動(dòng)于都可在哺乳類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。另外也有人采用來(lái)自哺乳動(dòng)物和禽類的啟動(dòng)子。Fynan等1993年將編碼流感病毒血凝素H或H7的CDNA片段插入CMV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的下游，構(gòu)建了抗流感病毒的核酸疫苗，另外，乙型肝炎病毒、人免疫缺陷綜合癥病毒、腦膜炎病毒等基因均被成功地克隆到含CMV啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體上，并表現(xiàn)了免疫活性。用于構(gòu)建核酸疫苗的病毒載體包括流感病毒裁體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)載體、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。1994年Castrucci?MR[6|把可以引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的致死性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV〉的表位基因片段克隆到流感病毒（H1N1〉的基因組中制備核酸疫苗，免疫小鼠后，可使小鼠抵抗致死性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的攻擊，其免疫效果可維持4個(gè)月以上。二核酸疫苗的特點(diǎn)與伎統(tǒng)的滅活疫苗、弱毒疫苗和基因H程疫苗相比，核酸疫苗具有如下特點(diǎn)：（1）免疫效果好，基因疫苗能在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生外源性蛋白，此種蛋白比原核生物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白更象天然分子，其抗原識(shí)別遞呈過(guò)程與自然感染十分相似，從而引起幾乎等同于感染這些病原體或弱毒疫苗免疫后所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，并且避免了基因重組技術(shù)在體外合成的蛋白質(zhì)抗原表位丟失或改變。（2〉利用一種表達(dá)載體同時(shí)表達(dá)多種蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種病原體的免疫應(yīng)答°從而起到一次注射核酸疫苗同時(shí)預(yù)防和治療多種疾病的效果，并可抵抗某些變異病原體的侵襲（3）核酸疫苗接種后，蛋白質(zhì)抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)，可直接與MHCI類和MHCII類分子結(jié)合，引起廣泛的細(xì)胞免疫和體液免疫，但無(wú)毒力返祖的危險(xiǎn)（4）安全性好，由于核酸疫苗一般釆用表達(dá)載體在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行抗原表達(dá)，不與宿主染色體DNA整合，但能在宿主體內(nèi)表達(dá)，與病毒活疫苗相比，避免了病毒本身存在的復(fù)毒和病毒基因組整合到宿主染色體的危險(xiǎn)（5〉核酸疫苗具有共同的理化特性，可在同一載體上構(gòu)建表達(dá)多種抗原，生產(chǎn)多價(jià)疫苗或同時(shí)注射2種以上的核酸疫苗來(lái)進(jìn)行聯(lián)合免疫（6〉制備簡(jiǎn)單，利用成熟的基因重組技術(shù)，將克隆的目的基因DNA直接接種，避免了表達(dá)載體的構(gòu)建，表達(dá)產(chǎn)物的提取等繁瑣過(guò)程（7）由于核酸疫苗作為重組質(zhì)粒*能在工程菌內(nèi)快速大量增殖，且提 好資料惟薦 取方法簡(jiǎn)便，可使生產(chǎn)成本降低，并能加工干燥，便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。三核酸疫苗免疫機(jī)理對(duì)核酸疫苗免疫機(jī)理說(shuō)法不一，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，其致病機(jī)理在于他模擬了病毒的自然感染過(guò)程。DNA質(zhì)粒在注射部位被肌細(xì)胞吸收攝取后，通過(guò)所含的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子系統(tǒng)調(diào)節(jié)合成所編碼的蛋白質(zhì)，合成的蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶復(fù)合體降解成含病毒抗原表位的肽段，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與合成MHCI類分子結(jié)合，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)遞呈到細(xì)胞膜表面，此復(fù)合體共同激活CD8+CTL,部分被分泌或釋放入血的蛋白質(zhì)，激活特異性B細(xì)胞，從而產(chǎn)生保護(hù)性抗體；另外，分泌的蛋白質(zhì)被巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞等專職抗原遞呈細(xì)胞俘獲，被加工成肽段，進(jìn)入溶酶體丿內(nèi)體區(qū)與MHCII類分子結(jié)合，激活受MHCII類分子限制的CD4+Th細(xì)胞，被激活的Th細(xì)胞分泌IFN-Y，IL-2等細(xì)胞因于，，進(jìn)一步促逬和強(qiáng)化體液免疫和細(xì)胞免疫。另外，試驗(yàn)證明質(zhì)粒上的氨茉青霉素抗性選擇基因中的回文結(jié)構(gòu)5’?AACGTT?3'能夠使單核細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介紊?12,刺激細(xì)胞分泌干擾素，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，稱為“單鏈免疫刺激DNA序列”起到佐劑的作用。四核酸疫苗的接種方式核酸疫苗可以通過(guò)多種方式、途徑接種到機(jī)體的適當(dāng)部位，不同的接種方式或途徑可影響其免疫效果。接種途徑依啟動(dòng)子的來(lái)源而有所區(qū)別，用動(dòng)物病毒和一般哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子構(gòu)建的DNA疫苗一般用生理鹽水稀釋質(zhì)粒DNA肌肉注射法，如股四頭肌和腓腸肌等骨骼肌因?yàn)槠涮厥饨Y(jié)構(gòu)如肌漿網(wǎng)、橫向微管系統(tǒng)，適合于攝取和表達(dá)DNA,兼之其注射方便，因而常被選為接種組織，也可選擇肌肉皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)接種。而用來(lái)自乳腺的乳清酸蛋白(WAP)啟動(dòng)子構(gòu)建的疫苗在乳腺和皮下脂肪接種效果更好；也有鼻腔內(nèi)滴鼻法進(jìn)行黏膜吸附免疫接種。第二種方法是用高速度來(lái)提高疫苗DNA對(duì)組織的轉(zhuǎn)染率和表達(dá)效率，一般用特殊工具■基因槍接種，基因槍能將包裹在金粒上的質(zhì)粒DNA直接注射進(jìn)表皮細(xì)胞。用基因槍接種比直接注射核酸疫苗的免疫效果好60-600倍。用基因槍接種只需0.4-0.004jig純化DNA,而肌肉注射需100-200gg的核酸疫苗，才能獲得很明顯的免疫效果。Fynan[2]等人進(jìn)行了不同方式接種流感病毒核酸疫苗免疫效力的研究證明上述二者的接種效果均高于靜脈、鼻腔、真皮、皮下等其它接種方式，但不同宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫接種效果并不完全一致。第三種方法是將組織預(yù)先用藥物如丁哌卡因、心肌毒素和高滲蔗糖等處理，增加組織細(xì)胞對(duì)疫苗DNA的攝取和表達(dá)能力，稱為“藥物協(xié)助法”。另有人將疫苗DNA與粒細(xì)胞、巨噬集落刺激因子表達(dá)裁體或一些細(xì)胞因子等一起或分別注射均能明顯的提高疫苗免疫效率。還有用腺病毒介導(dǎo)或脂質(zhì)體介導(dǎo)注射方法的報(bào)道，但存在潛在癌基因激活及缺乏細(xì)胞的導(dǎo)向性等缺點(diǎn)。五核酸疫苗免疫效果的影響因素表達(dá)載體對(duì)核酸疫苗的影響表達(dá)載體對(duì)核酸疫苗的效力有很大的影響，表達(dá)載體主要以pUC和pBR322質(zhì)粒為基本骨架，含DNA復(fù)制起始點(diǎn)、抗生素抗性基因、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和3'多聚A終止信號(hào)等結(jié)構(gòu)，能在大腸桿菌中穩(wěn)定地復(fù)制.但不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。其中控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)裁體的影響最大。啟動(dòng)子因來(lái)源不同有組織特異性，并且在各種組織中起始niRNA合成的效能也不同?；蛞呙缰谐Ｓ玫膩?lái)自病毒的啟動(dòng)子包括猴病毒40<SV40)早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV〉早期啟動(dòng)子及羅斯肉瘤病毒(RSV〉啟動(dòng)子等，這些啟動(dòng)子的組織特異性較廣，在許多組織細(xì)胞中能較好地表達(dá)外源基因，且在肌肉組織中的表達(dá)效率最高。Davis等曾將HBSAG基因分別克隆到含CMV和RSV啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體上，注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)含CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于后者?，F(xiàn)在大多采用CMV啟動(dòng)子。也有人用來(lái)自哺乳動(dòng)物和禽類的啟動(dòng)子如人0-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、乳清酸蛋白(WAP〉啟動(dòng)于、綿羊金屬硫蛋白啟動(dòng)子和雞B■肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子［20-21］等構(gòu)建基因疫苗。這些啟動(dòng)子在肌肉內(nèi)都有較好的轉(zhuǎn)錄活性°而WAP啟動(dòng)子則在乳腺和皮下脂肪表達(dá)效率最高。另外，Danko等［22］報(bào)告，共價(jià)閉壞型的質(zhì)粒pRSVLDNA的表達(dá)效率遠(yuǎn)髙于線性質(zhì)粒pRSVLDNA。DNA輸入組織的方式DNA輸入組織可以用注射"脂質(zhì)體包裹后注射、基因槍轟擊r口服等。其免疫效果因注射速度、導(dǎo)入速度、免疫劑量、接種部位、及宿主細(xì)胞不同而各有差異。另外肌肉注射前用蛇毒、心肌莓素、高滲蔗糖(25%UW,用PBS溶解〉“丁哌卡因等預(yù)處理，可顯著提高外源基因的表達(dá)。佐劑；Arom、QSI、細(xì)胞因子如IL?2等均可改變或提高核酸疫苗的免疫效力。機(jī)體免疫反應(yīng)：由于核酸疫苗導(dǎo)入體內(nèi)加工后表達(dá)既可激活CD8+TCL細(xì)胞，引起細(xì)胞免疫，表現(xiàn)出外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)、白細(xì)胞介素2、Y干擾素分泌增加、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)等表現(xiàn)。又能通過(guò)分泌抗原表達(dá)，激活TH細(xì)胞或直接激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，故筆者認(rèn)為機(jī)體免疫機(jī)能狀態(tài)也是影響其免疫效力的主要原因之O六核酸疫苗的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景自從90年核酸疫苗誕生之日起，學(xué)者們先后將一些不同病原體抗原基因的質(zhì)粒DNA克隆到適宜的真核表達(dá)載體中，并接種于相應(yīng)的動(dòng)物體內(nèi)，引發(fā)了特異性的免疫應(yīng)答，對(duì)野毒株的攻擊具有保護(hù)作用，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。目前，許多種細(xì)菌、病毒.寄生蟲(chóng)的核酸疫苗得到了廣泛的應(yīng)用°井取得了良好的臨床保護(hù)效果。Ulmer等（1993〉首先報(bào)道將流感病毒高度保守的核蛋白（NP〉的cDNA克隆于質(zhì)粒裁體中，構(gòu)建成表達(dá)NP的核酸疫苗，取適量注入小鼠的股四頭肌，誘導(dǎo)出抗NP的特異性培G抗體和CTL應(yīng)答。由于保護(hù)性抗原基因非常保守，故免疫小鼠即可抗同株流感病毒攻擊，又可抵抗異株流感病毒攻擊。愛(ài)滋病自本世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)以來(lái)，呈逐年成倍增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其高度的致死性與驚人的蔓延速度令人“談艾色變”，因此在世界范圍內(nèi)急需一種安全有效的HTV疫苗問(wèn)世，HIV中和抗原gpl20V3區(qū)序列存在一高度同源共有序列,以此作疫苗研制的靶抗原可能會(huì)擴(kuò)大疫苗的免疫保護(hù)范Ho目前有關(guān)HTV外殼糖蛋白的基因重組疫苗、合成肽疫苗、重組病毒活裁體苗正在積極研制中，但仍未取得另人滿意的的結(jié)果。1993年美國(guó)的WANG等率先應(yīng)用DNA疫苗技術(shù)將編碼HIV?1包膜糠蛋白基因cDNA重組質(zhì)粒pM160接種小鼠，產(chǎn)生了抗HTV-1包膜糖蛋白的特異性抗體，此抗體能中和HIV-1對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的感染，抑制HIV?1介導(dǎo)的體外培養(yǎng)細(xì)胞的合胞體的形成；并且還觀察到了特異性的T細(xì)胞增殖現(xiàn)象；同時(shí)他們通過(guò)小鼠、猴體內(nèi)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若在DNA注射前對(duì)局部肌肉用藥物預(yù)處理能明顯提高了動(dòng)物機(jī)體對(duì)HIV-1包膜糖蛋白的免疫應(yīng)答能力，并檢測(cè)到了特異的CTL應(yīng)答。1994年Davis等分別將乙型肝炎表面抗原基因插入到了帶CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒構(gòu)建了DNA疫苗，并肌肉注射小鼠體內(nèi),證明可在體內(nèi)產(chǎn)生類似于病毒感染的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答°Davis等研究人員證明注射部位藥物預(yù)處理后，可產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫效力。同時(shí)證明使用無(wú)針生物注射器（Eioiiijectoi:＞可將重組疫苗導(dǎo)入肌肉組織中.也能誘導(dǎo)對(duì)HBsAg的體液免疫反應(yīng)。國(guó)內(nèi)亦有對(duì)HBV核酸疫苗研究的報(bào)道。此外，針對(duì)人類病原微生物的核酸疫苗還包括HEV[28]狂犬病病毒[11]單純皰疹病毒結(jié)核病多種寄生蟲(chóng)LCMV[5]等。我們也構(gòu)建了編碼豬冠狀病毒（TGEV〉的主要抗原位點(diǎn)和完整刺突（Spike,S）基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)到了體內(nèi)和體外的表達(dá)。七核酸疫苗的安全性問(wèn)題核酸疫苗的性質(zhì)介于傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的生物治療劑與基因產(chǎn)品之間。由外源基因?qū)胍鸬膬?nèi)源性致癌基因的插入性激活和抑癌基因插入性激活的可能性往往被忽略《但核酸疫苗本質(zhì)圭要為外源DNA,并且目前構(gòu)建的DNA裁體來(lái)看，大都含有某些致癌病毒的DNA序列，如CMV、RSV的啟動(dòng)子序列。雖然通過(guò)對(duì)1800余中核酸疫苗的檢查沒(méi)有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入基因和宿主染色體DNA整合的證據(jù)，但核酸疫苗在應(yīng)用于人體之前，這個(gè)問(wèn)題須明確解決。目前對(duì)于抗DNA抗體的產(chǎn)生有兩種假設(shè)；1是由B淋巴細(xì)胞增生產(chǎn)生2由抗原DNA引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞活化和選擇產(chǎn)生，而抗DNA抗體的出現(xiàn)必然會(huì)誘發(fā)新的疾病。核酸疫苗注射機(jī)體后可長(zhǎng)期在體內(nèi)表達(dá)外源抗原，一方面，核酸疫苗表達(dá)的抗原在新環(huán)境中可能誘導(dǎo)不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，甚至在長(zhǎng)期表達(dá)狀態(tài)下誘導(dǎo)免疫耐受；另一方面，如果免疫應(yīng)答過(guò)程中有可能出現(xiàn)過(guò)度刺激并產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)性，后者在嚴(yán)重情況下導(dǎo)致自身免疫病的產(chǎn)生亦可發(fā)生超敏反應(yīng)。盡管這些推測(cè)尚屬假設(shè)*但仍具有可能性，一旦出現(xiàn)上述情況，很難逆轉(zhuǎn)，必須予以重視?，F(xiàn)階段疫苗的研制開(kāi)發(fā)正處于探索階段，各實(shí)驗(yàn)室所用的動(dòng)物、表達(dá)載體、基因片段、免疫途徑等尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大，安全性不能得到充分保證，因此有必要根據(jù)不同病原體等實(shí)際情況制定一套規(guī)范的準(zhǔn)則，使核酸疫苗的制備和應(yīng)用有