蛋白質的分離純化與結構分析

蛋白質的分離純化與結構分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein分離純化蛋白質的一般程序材料的預處理及細胞破碎通常選擇適當的緩沖液抽提蛋白質蛋白質粗制品的獲得進一步分離純化獲得蛋白純品提取*蛋白質的分離和純化的依據

溶解度分子大小電荷吸附性質等———蛋白質理化性質的差異

蛋白質的理化性質與常用的分離純化方法蛋白質的理化性質常用的純化方法分子質量透析、超濾凝膠層析離心溶解度調整pH調整離子強度降低介電常數電荷電泳等電聚焦離子交換層析特異結合性質親和層析其他性質吸附層析液相層析氣相層析一、透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。人工腎血液透析圖超濾（ultrafiltration）

在一定的壓力下，使蛋白質溶液在通過一定孔徑的超濾膜時，小分子量物質濾過，而大分子量的蛋白質被截留，從而達到分離純化的目的。磁力攪拌器待超濾的蛋白質溶液加壓的氮氣超濾膜

鹽析法有機溶劑沉淀法免疫沉淀法二、沉淀（precipitation）

鹽析法定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現象。原理:

破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等優(yōu)點：Pr不變性，常用試劑：丙酮、乙醇、甲醇等親水溶劑原理：與H2O結合，破壞水化層優(yōu)點：分辨率優(yōu)于鹽析法，能使某一Pr在狹小有機溶劑濃度范圍內沉淀。缺點：易使Pr變性應用：pI沉淀Pr。調節(jié)溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破壞水化膜，Pr沉淀。注意：防止Pr在分離過程中發(fā)生變性：①0－4℃下進行；

②有機溶劑濃度不能太高，Pr沉淀后立即分離有機溶劑沉淀法*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。免疫沉淀法：三、

電泳（electrophoresis）

定義：帶電粒子在電場中向著與其電性相反的電極移動的現象。Pr分子在溶液中可帶凈的負電荷或帶凈的正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同的蛋白質分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的泳動速度也不同，由此可彼此分離。幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)

常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳蛋白質組學研究的重要技術。

SDS等電聚焦（isoelectric

focusing,IEF）

+(H2SO4)

(NaOH)pH3pH10

+(H2SO4)

(NaOH)pI4.55.16.07.98.1pH3pH10等電聚膠電泳雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis）IEFSDS雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis）四、層析層析(chromatography)分離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的。蛋白質分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質分子大小不同分離。離子交換層析凝膠過濾大分子先洗脫下來小分子后洗脫下來五、超速離心(ultracentrifugation)*利用機械的快速旋轉所產生的離心力，將不同的物質進行分離*蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(sedimentationcoefficient,S)表示。因為沉降系數S大體上和分子量成正比關系，故應用超速離心法既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。蛋白質的分離純化：小結1、透析、超濾根據性質：分子大小2、鹽析根據性質：蛋白質的沉淀作用機理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層影響因素：表面電荷、水化層、溶劑性質3、電泳：根據性質：蛋白質的兩性解離作用機理：異性電荷互相吸引影響因素：電荷種類及數量、分子大小及形狀溶液離子強度及pH等4、層析（1）離子交換層析：電荷、分子量、分子形狀（2）親和層析：生物特性（3）吸附層析：吸附特性（4）凝膠過濾層析（分子篩）：分子大小及形狀大分子先洗脫下來5、超速離心：分子大小及形狀、溶液特性六、多肽鏈中氨基酸序列分析分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。COOHH2NCN

CN

CN

C

N分析殘基組成Edman降解法排列組合計算六、多肽鏈中氨基酸序列分析通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列按照三聯密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質的基因測定DNA序列排列出mRNA序列七、蛋白質空間結構測定*二級結構測定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。*三級結構測定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。同源模建：將待研究的序列與已知結構的同源蛋白質序列對齊——補償氨基酸替補、插入和缺失——通過模建和能量優(yōu)化計算，產生目標序列三維結構。序列相似性越高，預測的模型也越準確。折疊識別：通過預測二級結構、預測折疊方式和參考其它蛋白的空間結構，從而產生目標序列的三維結構。從無到有：根據單個氨基酸形成二級結構的傾向，加上各種作用力力場信息，直接產生目標序列三維結構。根據蛋白質的氨基酸序列預測其三維空間結構：小結掌握1.蛋白質的元素組成特點，氨基酸的結構通式、氨基酸的分類、三字英文縮寫符號。2.蛋白質一、二、三、四級結構的概念及其主要的化學鍵。3.蛋白質二級結構的形式及α-螺旋，β-折疊的結構特點4.蛋白質的結構與功能的關系。5.蛋白質的理化性質：兩性電離，膠體性質，蛋白質變性的概念和意義，紫外吸收和呈色反應。熟悉肽、肽鍵與肽鏈的概念，多肽鏈的寫法。生物活性肽的概念。肽單元概念、模體、分子伴侶的概念。結構域的概念。蛋白質的分類。蛋白質的沉淀，等電點沉淀，凝膠過濾，超過濾和超速離心。蛋白質分離和純化技術：鹽析、電泳和分子篩的原理。1、重要名詞：氨基酸殘基亞基變構效應協同效應等電點蛋白質的變性分子伴侶模體結構域

分子病2、結構層次元素組成：C、H、O、N（16%）、S結構單位：20種L-α氨基酸一級結構：肽鍵；多肽鏈N端C端二級結構：穩(wěn)定力（氫鍵）；類型（螺旋，折疊，轉角，無規(guī)卷曲）三級結構四級結構3、結構與功能關系（舉例）4、重要性質：等電點及帶電狀態(tài)判定；膠體性質；紫外吸收；變性5、分離純化：透析；鹽析；丙酮沉淀；電泳；離子交換層析；分子篩本章小結1.試述蛋白質螺旋、折疊的結構特點。2.試比較蛋白質的一、二、三、四級結構及維持其穩(wěn)定的化學鍵。3.試舉例說明蛋白質（一級/高級）結構與功能的關系。4.試區(qū)別蛋白質的變性和變構。5.蛋白質定量測定的方法有哪些？問答題蛋白質含量測定法

微量凱氏定氮法：雙縮脲法：樣品量0.2-1.7mg/L改良Lowry法在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生應，生成藍色化合物，將其與雙縮脲法結合起來，形成兩種顏色的混合物，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25g-250g/ml.考馬斯亮藍法（Bradford法）

考馬斯亮藍G250是一種帶有負電荷的染料，在酸性條件下可與Pr上的正電荷結合，形成藍色化合物，在595nm具有特定吸收。紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260nm同測法。

蛋白質濃度mg/ml＝1.45A280-0.74A2601天然蛋白質中不存在的氨基酸是

A蛋氨酸

B胱氨酸

C羥脯氨酸

D同型半胱氨酸

E精氨酸2下列哪種氨基酸在肽鏈中形成拐角

A纈氨酸

B酪氨酸

C脯氨酸

D蘇氨酸

E色氨酸3下列有關蛋白質β折疊結構的敘述正確的是

A.主鏈骨架呈鋸齒狀

B.兩個相鄰的肽平面呈折紙狀

C.β折疊結構是一種較伸展的肽鏈結構

D.若干矩齒狀肽鏈骨架平行或反平行排列，鏈間靠氫鍵維系

E.以上都正確4.有關血紅蛋白(Hb)