第9章-離體授粉-副本

第9章離體授粉1離體授粉的概念和種類1.1離體授粉的概念離體授粉（pollinationinvitro）是指將未授粉的胚珠或子房從母體上分別下來(lái)，進(jìn)行無(wú)菌培育，并以確定的方法授以無(wú)菌花粉，使之在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精的技術(shù)，又稱為離體受精（fertilizationinvitro）或試管受精（testtubefertilization）。1.2離體授粉的種類依據(jù)無(wú)菌花粉授于離體雌蕊的位置，可將離體授粉分為離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉三種方式。1.2.1離體柱頭授粉離體柱頭授粉是指通過(guò)雌蕊的離體培育，使無(wú)菌花粉授于柱頭上，得到含有可育的種子和果實(shí)的技術(shù)（圖7－1a）。離體柱頭授粉是接近于自然授粉的試管受精技術(shù)。操作方法：取花藥未開裂的母本花蕾表面消毒剝離雌蕊離體培育授以無(wú)菌粉圖7－1離體授粉3種方式示意圖1.2.2離體子房授粉子房?jī)?nèi)授粉（intraovarianpollination）：通過(guò)人工方法將花粉干脆引入子房，使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)，并進(jìn)行正常受精，最終獲得具有生活力的種子。把花粉干脆送人子房，實(shí)現(xiàn)受精作用是克服受精前障礙的有效途徑。子房?jī)?nèi)授粉可分為兩種類型，即活體子房?jī)?nèi)授粉和離體子房?jī)?nèi)授粉。1.2.2.1活體子房?jī)?nèi)授粉活體子房?jī)?nèi)授粉是指被授粉的子房并不離體，仍舊在活體植株上，對(duì)其用花粉懸浮液進(jìn)行授粉，使活體子房發(fā)育并形成成熟種子的過(guò)程?；铙w子房?jī)?nèi)授粉的操作步驟：①確定供試植物的開花和花藥開裂時(shí)間；②對(duì)母本花蕾去雄并套袋；③采集父本花粉；④確定適于父本花粉萌發(fā)的溶液；⑤將花粉引入子房（干脆引入法、注射法）。1.2.2.2離體子房?jī)?nèi)授粉離體子房?jī)?nèi)授粉是指用無(wú)菌花粉對(duì)離體培育的子房進(jìn)行授粉，使其發(fā)育成為成熟種子的技術(shù)（圖7-1b）。方法：取即將開花的花蕾，經(jīng)過(guò)表面消毒，剝離花萼和花瓣，去掉柱頭和花柱，在試管中將異種無(wú)菌花粉授于子房頂端的切口處，或?qū)惙N無(wú)菌花粉引入子房?jī)?nèi)（引入方法同活體子房?jī)?nèi)授粉），從而實(shí)現(xiàn)受精過(guò)程。圖7－1離體授粉3種方式示意圖1.2.3離體胚珠授粉離體胚珠授粉是指離體培育未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最終在試管內(nèi)結(jié)出正常種子的技術(shù)（圖7-1c）。可以是單個(gè)胚珠（袒露胚珠），也可以是帶有完整胎座或部分胎座的胚珠。圖7－1離體授粉3種方式示意圖1.3幾種授粉方法比較活體子房?jī)?nèi)授粉適用于子房較大的植物，可克服柱頭和花柱組織上出現(xiàn)的兩性不親和性。但對(duì)子房易脫落的植物不適用。離體柱頭授粉解決了子房脫落和因胚乳發(fā)育不良使胚敗育等問(wèn)題。但不能克服因柱頭和花柱組織造成的不親和性的障礙。離體子房?jī)?nèi)授粉和離體胚珠授粉既可解除柱頭和花柱組織對(duì)于受精的障礙，又可克服活體子房的脫落。2離體授粉的意義有性雜交是常規(guī)育種的一個(gè)主要手段，但有性雜交存在的問(wèn)題：（1）受精前障礙（合子期前障礙）:①花粉在柱頭上不能萌發(fā)；②花粉管不能進(jìn)入胚珠；③花粉管在花柱中裂開。克服受精前障礙的方法有蕾期授粉、截?cái)嗷ㄖ?、?duì)花柱進(jìn)行熱處理、輻照處理、混合花粉授粉等。另外，通過(guò)離體授粉，把花粉粒干脆送入子房，讓花粉干脆與胚珠接觸，可消退柱頭和花柱的障礙，從而實(shí)現(xiàn)受精并使種子得到發(fā)育和成熟。這就是離體授粉的意義。（2）受精后障礙：受精能正常進(jìn)行，但由于胚和胚乳之間的不親合性或胚乳發(fā)育不良，雜種胚不能發(fā)育成熟。這屬于受精后障礙。因受精后障礙而導(dǎo)致遠(yuǎn)緣雜交的失敗，可接受胚培育或子房培育或胚珠培育予以克服。3離體授粉的操作技術(shù)3.1試驗(yàn)材料的選擇在進(jìn)行離體授粉試驗(yàn)時(shí)，最好選用子房較大并有多個(gè)胚珠的植物，如茄科、罌粟科、石竹科的植物等。在單子葉植物中，最先獲得成功的是玉米的離體子房授粉，后來(lái)離體胚珠授粉也獲得成功（圖7-2）。不論離體柱頭授粉還是胚珠授粉，多保留母體花器官組織有利于離體授粉的成功。圖7－2玉米子房示意圖3.2離體授粉的程序①確定開花、花藥開裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和受精的時(shí)間；②去雄后將花蕾套袋隔離；③制備無(wú)菌子房或胚珠；④制備無(wú)菌花粉；⑤胚珠（或子房）的試管內(nèi)授粉。離體授粉成功的標(biāo)記：授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的種子。4胚珠和子房培育4.1胚珠培育4.1.1胚珠培育的概念和意義胚珠培育的概念：胚珠培育是將胚珠從母株上分別出來(lái)，在人工限制的條件下，進(jìn)行離體培育，使其生長(zhǎng)發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。依據(jù)培育目的的不同，可將胚珠培育分為受精胚珠培育和未受精胚珠培育。胚珠培育的意義：①通過(guò)未受精胚珠的培育作為試管受精的基礎(chǔ)②通過(guò)受精胚珠的培育，防止雜種胚早期敗育，獲得雜種植株③通過(guò)未受精的胚珠培育，誘導(dǎo)出大孢子或卵細(xì)胞增殖，產(chǎn)生單倍體植株4.1.2胚珠培育的技術(shù)措施（1）材料的選擇和滅菌受精胚珠：可依據(jù)培育的要求，由大田或溫室取回授粉時(shí)間合適的子房。未受精胚珠：在授粉前適當(dāng)時(shí)間摘取子房，進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌條件下剝離。用解剖刀沿縱軸切開子房，取出一個(gè)個(gè)胚珠，或者將帶有胎座部分的胚珠一起取下接種。（2）培育基基本培育基：多為White、Nitsch、MS等，Nitsch運(yùn)用更普遍。不同發(fā)育時(shí)期的胚珠對(duì)培育基的要求也不同。發(fā)育時(shí)期越早的胚珠對(duì)培育基的要求越困難。如罌粟。離體胚珠發(fā)育中，培育基的滲透壓起著重要的作用，特殊是對(duì)幼嫩的胚珠。（3）胎座和子房對(duì)胚珠培育的影響胚珠是否帶有胎座，對(duì)培育的胚珠發(fā)育有顯著的影響。對(duì)帶有胎座或子房的胚珠進(jìn)行培育時(shí)，所需培育基較簡(jiǎn)潔，而且受精后的胚珠也簡(jiǎn)潔發(fā)育成種子。緣由：胎座或子房的某些組織在胚珠發(fā)育初期起著重要的作用。（4）胚發(fā)育時(shí)期的影響胚珠授粉后的天數(shù)對(duì)培育的胚珠發(fā)育也有顯著的影響。一般來(lái)說(shuō)，合子和早期原胚期的胚珠較難剖取和培育，對(duì)培育基成分也要求嚴(yán)格。培育發(fā)育到球形胚期的胚珠，較簡(jiǎn)潔獲得種子，對(duì)培育基的要求也不高。4.2子房培育4.2.1子房培育的概念和意義子房培育的概念：子房培育是指將子房從母體上分別下來(lái)，置于培育基上，使其進(jìn)一步發(fā)育成幼苗的技術(shù)。類型：依據(jù)培育的子房是否授粉，可將子房培育分為授粉子房培育和未授粉子房培育。子房培育的意義：①通過(guò)未授粉子房培育，使未受精胚囊中的單倍性細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育成單倍體植株②通過(guò)授粉子房培育獲得雜種植株③通過(guò)未授粉子房培育作為試管受精的基礎(chǔ)4.2.2子房培育的操作技術(shù)（1）子房外植體的制備①子房外植體的選擇：對(duì)未受精的子房，一般選用開花前1～5d大田種植植株的子房；對(duì)受精后的子房，依據(jù)培育目的，選擇授粉后不同天數(shù)的子房。②表面消毒后（消毒技術(shù)？），將子房接種于合適的培育基上進(jìn)行培育。（2）培育基基本培育基：用于子房培育的培育基有MS、White、B5、N6、Nitsch等。培育基的成分對(duì)子房的生長(zhǎng)發(fā)育及成熟有很大的影響，如屈曲花（p143）。（3）培育子房的發(fā)育未受精子房：由于在子房中存在兩種細(xì)胞，即性細(xì)胞和體細(xì)胞，它們都可產(chǎn)生胚狀體或愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成植株。來(lái)源于性細(xì)胞的植株是單倍體植株；而來(lái)源于體細(xì)胞，即由珠被和子房壁表皮二倍體組織產(chǎn)生的植株，則屬二倍體。受精子房：可干脆發(fā)育成果實(shí)，或誘導(dǎo)合子形成胚狀體或愈傷組織，從而獲得雜種植株。（4）影響子房培育的因素由于子房培育的目的不同，要求子房的發(fā)育途徑也不一樣，可以通過(guò)限制培育基及激素條件調(diào)整子房發(fā)育的方向。此外，離體培育的探討表明，花被的功能不是僅僅充做性器官的愛護(hù)結(jié)構(gòu)，在果實(shí)和胚胎的發(fā)育中它也起著重要的作用（p143）。5離體授粉中影響牢固的因子5.1外植體（p144～145）5.1.1柱頭和花柱的影響柱頭是某些植物受精前的障礙，要克服這種障礙，必需去掉柱頭和花柱。假如不是受精前的障礙，則會(huì)使牢固率降低。5.1.2胎座的影響在試管受精中，子房或胚珠上帶有胎座，有利于離體受精的成功。同時(shí)多胚珠子房的離體受精也易成功。5.1.3外植體的生理狀態(tài)由雌蕊上剝離胚珠的時(shí)間。開花后1～2d剝離的胚珠比開花當(dāng)天剝離的胚珠牢固率高。剝離胚珠或雌蕊時(shí)雌蕊的生理狀態(tài)。剝離胚珠的時(shí)間選擇在雌蕊授粉后和花粉管進(jìn)入子房之前。授粉時(shí)的操作5.2培育基離體授粉涉及到兩個(gè)主要過(guò)程：①花粉粒的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，結(jié)果導(dǎo)致受精；②受精的胚珠發(fā)育為成熟的種子，里面有一個(gè)有生活力的胚。第一個(gè)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)潔培育基最重要的作用在于促進(jìn)受精胚珠的正常發(fā)育。5.2培育基培育基因素包括培育基的種類（Nitsch、White、MS等）Ca2+具有刺激花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的作用蔗糖的濃度：一般4％～5％，玉米7%各種生長(zhǎng)調(diào)整物質(zhì)和有機(jī)附加物5.3培育條件光照：在離體授粉中，培育物一般都是在黑暗或光照較弱的條件下培育的。溫度：離體授粉培育的溫度一般為20～25℃5.4基因型離體子房培育與牢固之間的效應(yīng)取決于植物的種類。6離體授粉的應(yīng)用（1）克服自交不親合性（2）克服雜交不親合性（應(yīng)用潛力最大）（3）通過(guò)孤雌生殖產(chǎn)生單倍體（4）培育抗逆性植物7單個(gè)雌雄配子的體外受精20世紀(jì)90年頭，植物生物技術(shù)領(lǐng)域中一項(xiàng)里程碑式的進(jìn)展，是高等植物離體雌雄配子成功地實(shí)現(xiàn)了體外融合，融合