吳梧桐主編生物制藥工藝學學習筆記

第一章生物藥物概論1、生物藥物的分類：（1）基因重組多肽、蛋白類治療劑（2）基因藥物（3）天然生物藥物（4）合成與部分合成的藥物。DNA重組藥物和基因藥物的區(qū)別：DNA重組藥物即應用重組DNA技術(shù)（包括基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)）制造的重組多肽、蛋白質(zhì)類藥物和疫苗、單克隆抗體與細胞因子等；基因藥物即以基因物質(zhì)（DNA或RNA）為基礎，研究而成的基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酶等。2、生物藥物的作用特點：藥理學特性：（1）藥理活性高（2）治療的針對性強，治療的生理、生化機制合理，療效可靠。（3）毒副作用較少，營養(yǎng)價值高。（4）生理副作用常用發(fā)生。理化特性：（1）生物材料中的有效物質(zhì)含量低，雜質(zhì)種類多且含量相對較高。（2）生物活性物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)復雜、穩(wěn)定性差。（3）生物材料易染菌，腐敗。（4）生物藥物制劑的特殊要求。3.DNA重組藥物有：（1）細胞因子干擾素類：a-干擾素、B-干擾素、丫-干擾素（2）細胞因子白介素類和腫瘤壞死因子：白介素-2（IL-2）和突變型白介素-2（Ser125-IL-2）腫瘤壞死因子類主要有TNF-a和TNF-a受體。（3）造血系統(tǒng)生長因子類：粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細胞粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）、促紅細胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干細胞生長因子（SCF）（4）生長因子類：胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、血小板衍生生長因子（PDFD）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-a和TGF-8）、神經(jīng)生長因子及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。（5）重組多肽與蛋白質(zhì)類激素：重組人胰島素僅供個人學習參考（rhlnsulin）、重組人生長激素（rhGH）、促卵胞激素FSH）、促黃體生成素（LH）和絨毛膜促性腺激素（HCG）、重組人白蛋白和重組人血紅蛋白（6）心血管病治療劑與酶制劑：而因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、鏈激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖腦苷酶及DNsae等（7）重組疫苗與單抗制品：重組乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和腫瘤疫苗。4術(shù)語藥物：用于預防、診斷、治療保健的一類物質(zhì)。藥品：是指用于預防、治療、診斷人體疾病，有目的地調(diào)節(jié)人體生理功能并規(guī)定有適應證或者功能主治、用法和用量的物質(zhì)，包括中藥材、中藥飲片、中成藥、化學原料藥及其制劑、抗生素、生化藥品、放射性藥品、血清、疫苗、血液制品和診斷藥品等。藥品根據(jù)其來源可分兩大類：天然藥物即植物藥、動物藥和礦物藥；合成藥包括化學合成藥與微生物合成藥。天然藥物一般來源于自然界，很少有人工加工過程，藥物成分相對較復雜。生化藥物：（biopharmaceutics）是利用生物體、生物組織、細胞或其成分，綜合應用生物學與醫(yī)學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的原理與方法加工制造而成的一大類用于預防、診斷、治療和康復保健的制品。DNA重組藥物：即應用重組DNA技術(shù)（包括基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)）制造的重組多肽、蛋白質(zhì)類藥物和疫苗、單克隆抗體與細胞因子等?；蛩幬铮阂曰蛭镔|(zhì)（RNA和DNA及其衍生物）作為治療的物質(zhì)基礎，包括基因治療用的重組目的DNA片段、重組疫苗、反義藥物和核酸等。僅供個人學習參考生化藥物：是運用生物化學的理論、方法、技術(shù)與研究成果，從生物體（包括動物、植物、微生物和海洋生物）分離、純化得到的一些重要生理活性物質(zhì)，經(jīng)藥效學和毒理學研究證明對于疾病的防治是安全有效的一大類藥物，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、維生素、激素、糖類、脂類、核酸、核苷酸及其衍生物。反義藥物：是以人工合成的10?幾十個反義寡核苷酸序列與模板DNA或mRNA互補形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯，從而起到抗腫瘤和抗病毒作用，目前有20多種反義藥物進入臨床試驗，其中ISIS是FDA批準的第一個反義藥物，用于治療AIDS病患者的巨噬細胞病毒性視網(wǎng)膜炎。核酸疫苗：將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接導入動物細胞內(nèi)，并通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白質(zhì)，誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白質(zhì)的免疫應答以達到防病治病的目的。第二章生物制藥工藝學技術(shù)基礎1、生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥的方法：生物活性物質(zhì)的濃縮：（1）鹽析濃縮（2）有機溶劑沉淀濃縮（3）用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮（4）用聚乙二醇小￡6）濃縮（5）超濾濃縮（6）真空減壓濃縮與薄膜濃縮生物活性物質(zhì)的干燥：（1）減壓干燥（2）噴霧干燥（3）冷凍干燥2簡述生物活性物質(zhì)分離純化的主要原理：根據(jù)混合物中的不同組分分配率的差別，把它們分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，或者將混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多組分分配于不同區(qū)域，從而達到分離的目的。主要純化原理有：（1）根據(jù)分子的形狀和大小不同進行分離（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進行分離（3）根據(jù)分子極性大僅供個人學習參考小及溶解度的不同進行分離。（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進行分離（5）根據(jù)配體特意性進行分離3、保存菌種、菌種退化、檢查菌種退化常用的菌種保存方法：斜面低溫保藏法、液體石蠟封藏法、冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法、甘油冷凍保藏法、其他如沙土管保藏法。菌種的退化意味著隨時間的推移菌種的一個或多個特性逐步減退或消失，最終導致營養(yǎng)細胞的死亡。一般把菌株的生活力、產(chǎn)抱子能力的衰退和特殊產(chǎn)物產(chǎn)量的下降統(tǒng)稱為退化。檢查菌種退化：（1）單位容積中發(fā)酵液的活性物質(zhì)含量（2）瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)，（3）不同培養(yǎng)時期菌體細胞的形態(tài)和主要遺傳特征，如形成抱子的能力；（4）發(fā)酵過程的pH變動情況（5）發(fā)酵液的氣味、色澤4重組DNA技術(shù)基本原理，如何獲取目的基因基因工程是通過體外重組將甲生物體的基因轉(zhuǎn)入乙受體生物體內(nèi)進行表達的生物技術(shù)。獲取目的基因的方法有：（1）鳥槍克隆法（2）人工合成目的基因1、酶促方法2、化學合成法5常見的基因載體有，如何構(gòu)建基因重組體在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復制功能、并帶有選擇標記的載體分子進行酶切連接，獲的重組DNA分子。常見的基因載體有：鏈霉菌質(zhì)粒、芽抱桿菌載體、質(zhì)粒、噬菌體（phage）、黏粒（cosmid）、病毒載體等。6DNA重組體有主要有哪幾種表達系統(tǒng)？各有什么特點？基因工程包括轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工等過程。根據(jù)宿主細胞種類不同，分為原核基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核細胞作為表達宿主，如大腸桿菌、僅供個人學習參考枯草桿菌等；而真核基因工程則以真核細胞為表達宿主，如酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等。（1）大腸桿菌表達系統(tǒng)：遺傳背景比較清楚，使用安全、技術(shù)操作簡便，繁殖力強（20?30min即可繁殖一代），便于大規(guī)模培養(yǎng)，成本較低，表達水平較高（可達總蛋白的5%?6%），下游技術(shù)成熟、易于控制。目前使用最廣泛、最成功的表達系統(tǒng)。（2）酵母表達系統(tǒng)：①是真核表達體系，對表達蛋白可進行折疊和翻譯后的修飾與糖基化；②表達量高，如明膠表達量達14。8g/L;③培養(yǎng)成本低；④適用高密度發(fā)酵；⑤雜蛋白少，產(chǎn)物易純化。（3）哺乳動物表達系統(tǒng)：中國倉鼠卵巢細胞（CHO）和猴腎細胞（COS）優(yōu)點是能識別和剪切外源基因的內(nèi)含子并加工成為成熟的mRNA.但其培養(yǎng)技術(shù)難度大，成本高，研究與生產(chǎn)周期長。三體系表達特點比較表達體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危險大腸桿菌多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易部分可獲得高產(chǎn)一般對原核者好真核者稍差不大酵母多肽、菌體內(nèi)容易菌體真核的接不大蛋白質(zhì)或分泌可高產(chǎn)內(nèi)，稍近天然或糖基出細胞復雜僅供個人學習參考化蛋白哺乳動物細胞完整糖基化蛋白質(zhì)分泌出細胞較難成本高可高產(chǎn)簡單幾乎可為天然產(chǎn)物需注意有致癌因素7生物制藥工藝中試放大的目的，如何進行中試放大。中試放大是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究工作，對小試工藝能否成功地進入規(guī)模化生產(chǎn)至關(guān)重要。這些研究工作都是圍繞著如何提高收率，改進操作，提高質(zhì)量，形成批量生產(chǎn)等方面進行。中試放大的方法有經(jīng)驗放大法，相似放大法和數(shù)學模型放大法。主要采用經(jīng)驗放大法。8術(shù)語微生物純培養(yǎng)：系指只在單一種類存在的狀態(tài)下所進行的生物培養(yǎng)。所有微生物、植物和動物都可以進行這種培養(yǎng)，高等植物或動物的無菌培養(yǎng)（無菌飼養(yǎng)）也可說是一種純培養(yǎng)。純培養(yǎng)最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠滅菌和分離，是由巴斯德（L.Pasteur）和柯赫（R.Koch）建立起來的。在自然界中，有的培養(yǎng)條件很困難，特別是具有密切共生關(guān)系的生物及進行寄生性營養(yǎng)的生物；也有一些在理論上不可能進行純粹培養(yǎng)的生物。誘變育種：是指有意識地將生物體暴露于物理的、化學的或生物的一種或多種誘變因子，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。誘變育種主要包括出發(fā)菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株3個部分。蛋白質(zhì)工程：在基因水平上設計表達新功能蛋白。僅供個人學習參考轉(zhuǎn)基因動物：將外源基因?qū)氩溉閯游锏氖芫鸦蚺咛ブ?，使導入基因與受精卵染色體整合，并將外源基因穩(wěn)定地子代，使子代表現(xiàn)外源基因的性狀。蛋白質(zhì)組學：研究細胞、組織或個體全部蛋白質(zhì)的全部表達狀態(tài)與功能狀態(tài)，是后基因時代重要研究方向第三章、生物材料的預處理1、去處發(fā)酵液中的雜蛋白的方法：（1）加入凝聚劑（2）加入絮凝劑（3）變性沉淀（4）吸附（5）等電點沉淀（6）加各種沉淀劑2、去處發(fā)酵液中的鈣、鎂、鐵離子的方法：（1）離子交換法去鐵離子（2）沉淀法鈣與草酸鈉或草酸鎂的去處用草酸沉淀不完全，堿性條件下用磷酸鹽，或三聚磷酸鈉，生成絡合物（污染河水）3、影響絮凝效果的主要因素：絮凝劑分子量、絮凝劑用量、pH及操作條件絮凝劑分子量越大，鏈越長，吸附橋架效果就越明顯，但分子鏈越大，絮凝劑在水中的溶解度降低；絮凝劑濃度越低，增加用量有助于架橋，提高絮凝效果，但過多引起吸附飽和，在膠粒表面形成覆蓋層，使膠粒穩(wěn)定，降低絮凝效果；pH的變化影響離子型絮凝劑功能團的電離度，電離度的提高使電排斥作用增強，架橋能力最佳；攪拌應注意，剛開始攪拌迅速使絮凝劑分散，發(fā)揮絮凝作用，絮凝團形成后，高的剪切力會打碎絮凝團。4細胞破碎：方法原理特點機械法勻漿法基于液相的剪適用面廣，處理量大，速度快，工僅供個人學習參考

切力業(yè)廣泛使用，不適用某些高度分支微生物，產(chǎn)熱大，可能會生物活性物質(zhì)失活珠磨法研磨作用破碎適用面廣，處理量大，工業(yè)廣泛使用，產(chǎn)熱大，可能會生物活性物質(zhì)失活超聲波超聲波的空穴作用破碎產(chǎn)熱大，散熱不易，成本高，適用小量樣品破碎物理法干燥法菌體細胞膜滲透性變化，自溶較劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其他組分變性凍融法胞內(nèi)冰晶引起細胞膨脹破碎較溫和，但破碎作用較弱，常需反復凍融，實驗室使用滲透壓沖擊法滲透壓突然變化，細胞快速膨脹變化較溫和，但破碎作用較弱，常與酶法合用化學法化學試劑處理化學試劑溶解細胞或抽提某些細胞成分需選擇合適的試劑，減少對活性物質(zhì)的破壞，可應用于大規(guī)模生產(chǎn)制成丙酮粉丙酮迅速脫水，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的鍵迅速脫水，減少蛋白質(zhì)變性，促進某些結(jié)合酶釋放生物法酶解法用酶反應分解反應條件溫和，但成本較高，一般僅供個人學習參考破壞細胞壁上特有的化學鍵僅適用于小規(guī)模應用組織自溶法利用組織中酶改變、破壞細胞結(jié)構(gòu)、使組織自溶反應條件溫和、成本低，不適用于易受酶降解的目的物的提取5、超聲波破碎細胞的原理：超聲波的破碎作用與液體中空穴的形成有關(guān)。當超聲波在液體中傳播時，液體中的某一小區(qū)域交替重復地產(chǎn)生巨大的壓力和拉力。由于拉力的作用，出現(xiàn)細小的空穴。這種空穴泡在超聲波的繼續(xù)作用下，又迅速閉合，產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的黏滯性旋渦在懸浮細胞上造成了剪切應力，促使其內(nèi)部液體發(fā)生流動，而使細胞破碎。術(shù)語：凝聚作用：(coagulation)是指在某些電解質(zhì)的作用下，使膠體粒子的擴散雙電層的排斥作用降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。絮凝作用：(flocculation)是指在膠體懸浮液中加入絮凝劑后，膠粒可強烈吸附在絮凝劑表面的功能團上，而且一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團沉淀的過程。滲透壓沖擊法：把細胞放在高滲溶液中，由于滲透壓的作用，細胞外的水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細胞快速膨脹而破裂，使產(chǎn)物釋放到溶液中。僅供個人學習參考

4、4、累的濾餅就會減少到可以忽略的程度，而通過過濾介質(zhì)的流速卻比較小。第四章萃取法1、溶液萃取法的基本原理：如某一抗生素在有機溶劑（不溶于水）中溶解度較大，當料液與有機溶劑接觸后，抗生素就從水相轉(zhuǎn)移到有機相中。另外，抗生素在不同pH條件下，可以有不同的化學狀態(tài)（如游離態(tài)酸、堿或成鹽），其分配系數(shù)亦有差別，若適度改變pH，可將抗生素自有機相再轉(zhuǎn)入水相，這樣反復萃取，可以達到濃縮和提純的目的。2、溶液萃取法按操作方式不同，可分為單級萃取和多級萃取，后者分為錯流萃取和逆流萃取。當萃取劑用量相同時，二級萃取收率比單級萃取收率高，在萃取用量一定的情況下，萃取次數(shù)愈多，則萃取愈完全。多級逆流與錯流萃取相比，萃取劑耗量較少，萃取液平均濃度較高。3、乳化劑能使乳化液穩(wěn)定：（1）、界面膜形成表面活性劑分子聚集在界面上，形成緊密吸附層，在分散相表面形成保護層。（2）、界面電荷的影響：O/W型乳狀液油滴多數(shù)是帶負電的，W/O型乳狀液中水滴則帶正電。產(chǎn)生排斥力。（3）、介質(zhì)黏度：乳化劑能增加乳狀液的黏度，增加保護膜的機械強度，則形成的界面膜不易被破壞，并可阻止液珠的聚結(jié)。4、破壞乳化劑的方法：（1）、加入表面活性劑（2）離心（3）加電解質(zhì)（4）加熱（5）吸附法破乳（6）高壓電破乳（7）稀釋法（8）其他途徑：超濾、反應萃取、中性磷萃取、脂肪類萃取劑僅供個人學習參考5、影響乳化劑類型的因素有：（1）乳化和破乳化（2）pH的影響（3）溫度和萃取時間的影響（4）鹽析作用的影響（5）溶劑種類、用量及萃取方式的選擇6、影響雙水相萃取的因素：（1）成相高聚物的分子量（2）成相高聚物濃度一一界面張力（3）電化學分配一一鹽類的影響（4）疏水效應（5）溫度及其他因素7、影響超臨界流體萃取的因素：（1）壓力的影響（2）溫度的影響（3）助溶劑（4）物料性質(zhì)的影響8術(shù)語雙水相萃?。翰煌母叻肿尤芤合嗷セ旌峡僧a(chǎn)生兩相或多相系統(tǒng)，利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相分配系數(shù)的差異來進行萃取的方法。雙節(jié)線：高聚物P、Q的濃度均以重量百分含量表示，相圖右上部為兩相區(qū)，右下部為均相區(qū)，兩相與均相的分界線叫雙節(jié)線多級錯流萃?。毫弦航?jīng)萃取后的萃余液再用新鮮萃取劑進行萃取的方法。多級逆流萃?。涸诘谝患壷屑尤肓弦海‵），萃余液順序作為后一級的料液，而在最后一級加入萃取劑（S），萃取液順序作為前一級的萃取劑。由于料液移動的方向和萃取劑移動的方向相反，故稱為逆流萃取。反膠束萃?。罕砻婊钚詣┤苡诜菢O性溶劑中，并使其濃度超過臨界膠束濃度，在有機溶劑內(nèi)形成聚集體，其中表面活性劑的非極性基團在外，與非極性的溶劑接觸，而極性基團在外，形成極性核，從而能夠溶解極性物質(zhì)，進行萃取。超臨界流體萃取：（supercriticalfluidSCF）是利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質(zhì)溶解能力來進行分離純化的技術(shù)。第五章沉淀和結(jié)晶1、鹽析沉淀是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀形式析出，從而達到純化目的的方法。僅供個人學習參考基本原理：一、鹽離子與蛋白質(zhì)表面具相反電性的離子基團結(jié)合，形成離子對，因此鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用減弱而能相互結(jié)合。二、中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)相互作用，使其沉淀。2、影響鹽析效果的因素：（1）無機鹽的種類（2）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）種類的影響（3）蛋白質(zhì)濃度的影響（4）溫度的影響（5）pH的影響3、影響沉淀效果的因素：（1）有機溶劑種類及用量（2）pH的影響（3）溫度（4）無機鹽的含量（5）某些金屬離子的助沉淀作用（6）樣品濃度4、形成過飽和溶液的方法：（1）蒸發(fā)法（2）溫度誘導法（3）鹽析結(jié)晶法（4）透析結(jié)晶法（5）有機溶劑結(jié)晶法（6）等電點法（7）微量擴散法（8）化學反應結(jié)晶法（9）共沸蒸餾結(jié)晶5、影響晶體大小的因素：（1）過飽和度：增加過飽和度能使成核速度和晶體生長速度加快，對前者影響較大，過飽和度增加，晶體較細小。（2）溫度快速冷卻，達到較高的過飽和度，晶體細小形成針狀晶；反之，緩慢冷卻得到較粗大的晶體。（3）攪拌速度：攪拌能促進成核和加快擴散，提高晶核長大的速度，過快則晶體會被打碎。經(jīng)驗表明，攪拌速度愈快，晶體愈細。（4）晶種加入晶種能誘導結(jié)晶，還能控制晶體的形狀、大小和均勻度。6、等電點沉淀的特點，如何應用對于兩性物質(zhì)，等電點時凈電荷為零，使穩(wěn)定的雙電層及水化膜變?nèi)趸蚱茐模肿娱g排斥電位降低，吸引力增大，相互聚集，產(chǎn)生沉淀。等電點沉淀法操作簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物質(zhì)少，常用的純化方法，主要適用于水化程度不大，僅供個人學習參考在等電點時溶解度很低的物質(zhì)。應用：胰島素純化時，在pH8。0除去堿性雜蛋白，調(diào)pH3。0除去酸性雜蛋白，粗提液經(jīng)此處理后純度大大提高，有利于后步提取操作。7術(shù)語Ks鹽析：在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析。B鹽析：在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析。鹽析分布曲線：蛋白質(zhì)沉淀的速度可用一dS/dP對鹽飽和度（P）作圖表示。蛋白質(zhì)沉淀的速率開始時十分迅速，以后變慢，從起始沉淀到沉淀結(jié)束，形成具有尖峰的曲線。透析結(jié)晶法：為了使蛋白質(zhì)溶解度的變化緩慢而且連續(xù)，而進行透析的方法；在鹽濃度緩慢降低的結(jié)晶情況下，進行透析。第六章吸附法1、化學吸附與物理吸附的區(qū)別：當吸附劑和吸附物之間作用力是通過分子間引力（范德華力）產(chǎn)生的吸附稱為物理吸附，最常見的一種吸附現(xiàn)象。在吸附劑和吸附物之間有電子的轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學反應而產(chǎn)生化學鍵，這種吸附稱為化學吸附。物理吸附是可逆的，可以是單分子層吸附或多分子吸附，選擇性較差。物理吸附與吸附劑的表面積、孔分布和溫度等因素有密切的關(guān)系?；瘜W吸附的選擇性強，即一種吸附劑只對某種或特定幾種物質(zhì)有吸附作用，只能形成單分子層吸附，吸附后較穩(wěn)定，不易解吸，平衡慢。項目物理吸附化學吸附作用力范德華庫侖力吸附力較小，接近液化熱較大，接近反應熱選擇性幾乎沒有有選擇性僅供個人學習參考吸附速度較快，需要活化能很小慢，需要較高的活化能吸附分子層單分子層或多分子層單分子層2、吸附劑及被吸附物的極性對吸附的影響:一般極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。極性吸附劑適宜從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑適宜從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)。如活性炭從水中吸附有機化合物；硅膠是極性的，適宜從有機溶劑中吸附極性物質(zhì)。3、吸附劑用量及吸附劑濃度對于吸附效果的影響：一般吸附物濃度大時，吸附量也大。由于雜質(zhì)存在，濃度升高后，吸附的雜質(zhì)量也上升，吸附選擇性差。提高吸附選擇性，常將料液適當稀釋。吸附量是指單位重量吸附劑所吸附物質(zhì)的量。4兩種以上常用吸附劑的性質(zhì)，用途。活性炭：吸附能力很強的非極性吸附劑。價格低，來源廣。除雜，生化藥物的分離。人造沸石：人工合成的無機陽離子交換劑。帶正電荷。與鈉離子交換。磷酸鈣凝膠：吸附作用主要是鈣離子與蛋白質(zhì)負電基團結(jié)合。白陶土：活性物質(zhì)分離純化的吸附劑，也可作為助濾劑與去除熱原的吸附劑。白陶土能吸附分子量較大的雜質(zhì)，包括導致過敏的物質(zhì)，常用它脫色。：氧化鋁：適用于親脂性成分的分離價廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手續(xù)繁瑣，處理量有限硅膠：活性強弱與自由水的含量有關(guān)，自由水多，活性低，自由水少，活性高。5、大網(wǎng)格高聚物吸附劑與傳統(tǒng)吸附劑相比的優(yōu)點：選擇性好、解吸容易，理化性質(zhì)穩(wěn)定，機械強度好，反復使用，流體吸力較小。6術(shù)語：僅供個人學習參考正吸附：吸附提取液中的有效成分。負吸附：去除提取液中的雜質(zhì)。大網(wǎng)格高聚物吸附劑：與大孔網(wǎng)狀離子交換樹脂具有相同的大網(wǎng)狀骨架，保留離子交換樹脂的功能團，性質(zhì)與活性炭、硅膠等吸附劑相似。第七章凝膠層析1、公式Ve=Vo+KdVi各字母的含義，凝膠層析的原理。Ve——淋出體積Vo——粒尖體積Vi——填料的孔體積Kd——排阻系數(shù)或分配系數(shù)凝膠層析原理：平衡排除理論一個高聚物分子的流出體積是由在宏觀的流動相和微觀的孔體積中的平衡分配系數(shù)所決定的。這里所謂的平衡是指擴散的平衡，即溶質(zhì)分子擴散進入一個填料顆?？字星以俪鰜硭枰臅r間遠小于溶質(zhì)區(qū)段在此停留的時間。換言之，當溶質(zhì)分子流過一個填料顆粒這段距離時，溶質(zhì)分子已多次進出于填料的孔，達到平衡。平衡條件只是在流速很慢時一個極端情況。2、常用凝膠的名稱、特點及用途。名稱特點用途葡聚糖凝膠(SephadexG)最常用，穩(wěn)定，對陽離子輕微吸附，多次重復使用分離修飾葡聚糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠化學穩(wěn)定好，成分不易脫落，適用pH廣，機械強度好，無帶電基團，分辨率較高瓊脂糖類凝膠僅供個人學習參考多孔玻璃微球化學穩(wěn)定性高、強度大、高壓下操作，好的流速；缺點是對糖類、葡萄糖吸附疏水性凝膠只適用分離分子量較小的物質(zhì)分離不溶水的有機物質(zhì)3、選擇凝膠：選擇何種凝膠及其型號、粒度，一方面是考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離分子量范圍，（滲入限與排阻限），理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等;另一方面還要注意分離目的和樣品的性質(zhì)。4、好的凝膠層析效果如何選柱、裝柱。選柱：層析柱的有效體積與柱比的選擇必須根據(jù)樣品的數(shù)量、性質(zhì)及分離目的加以確定。對于類分離，柱床體積一般微樣品溶液體積的5倍或略微多一些就夠了，柱比5：1或10：1，對于分級分離，要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，柱比在25~100之間。底端支持物滿足兩個條件：不易阻塞，死腔小。裝柱：正式裝柱前必須檢查柱底的凝膠支持物是否符合要求。要求不漏不堵，不吸附樣品，且能保持一定的流速。在裝柱時，連續(xù)攪拌下小心裝柱。開始裝柱時，避免膠粒直接沖擊支持物，空柱種應約留1/5的水或溶劑。所用的凝膠必須是用相應溶劑系統(tǒng)充分溶脹的。為了防止柱中出現(xiàn)氣泡，凝膠懸液溫度必須與室溫平衡并用水泵減壓排氣。進膠過程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠粒均勻沉降，使不發(fā)生凝膠分層和膠面傾斜。5、溶質(zhì)通過色譜峰時造成的峰加寬效應包括：（1）分子擴散：使用顆粒度小而均勻的填料可以降低擾動作用。僅供個人學習參考（2）渦流擴散：渦流擴散對凝膠色譜峰的加寬比較重要。應用小而均勻的填料緊密地裝在內(nèi)徑適當?shù)闹锌梢詼p少由渦流擴散造成的峰加寬，提高效柱。（3）流動相中傳質(zhì)阻力造成的色譜峰加寬。擴散速度越快，流速不平衡的影響就越小。（4）固定相中傳質(zhì)阻力造成的色譜峰加寬。填充介質(zhì)粒度越小所造成的峰加寬效應也小。溶液在柱外產(chǎn)生的峰加寬：（1）連接管路（2）檢測池6、利用凝膠層析測量蛋白質(zhì)的分子量。測定的依據(jù)是不同分子量的物質(zhì)，只要在凝膠的分離范圍內(nèi)（滲透限與排阻限之間），洗脫體積Ve及分配系數(shù)Kd值隨分子量增加而下降。對于一個特定體系，待測定物質(zhì)洗脫體積與分子量之間的關(guān)系：Ve=-KlgM+C（1）求解法以兩個已知分子量的蛋白質(zhì)過柱，求出C和K，將待測物的Ve代入得到M.（2）標準曲線法以多個已知分子量的標準蛋白過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標，lgM作橫坐標，，制作標準曲線。在同一測定體系中測取未知物質(zhì)的Ve，由標準曲線求得分子量。7術(shù)語柱比：層析柱的長度與直徑的比值操作壓：凝膠層析由于進出口之間液位差形成的對凝膠顆粒的壓力內(nèi)水體積：柱中凝膠顆粒內(nèi)部所含的液相體積。外水體積：凝膠柱床中凝膠顆粒之間的液相體積。類分離：分開樣品分子中分子量懸殊較大的兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。分級分離：分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。排阻系數(shù)：表征物質(zhì)分子進入凝膠顆粒的程度。全滲入：Kd=1全排阻：Kd=0分離限..分辨率：R二△Ve/（1/2（Wa+Wb））分辨率與洗脫體積的差值成正比，而與兩物質(zhì)的洗脫峰寬度成反比。僅供個人學習參考第8章離子交換1、離子交換常用洗脫方法：從樹脂上洗脫目的物的方法主要有兩種：（1）調(diào)節(jié)洗脫液的口出使目的物粒子在此pH下失去電荷，甚至帶相反電荷，從而喪失與原離子交換樹脂的結(jié)合力而被洗脫下來。（2）用高濃度的同性離子根據(jù)質(zhì)量作用定律將目的物離子取代下來。2、離子交換樹脂的命名法。舉兩種樹脂骨架。樹脂命名編號：強酸類1~100號，弱酸類101~200號，強堿類201-300號，弱堿類301-400號，中強酸401?500。各種樹脂除注明類別和編號外，還需標明載體的交聯(lián)度。書寫交聯(lián)度時，將百分號除去，寫在樹脂編號后并用乘號以“隔開。強酸1X7,交聯(lián)度為7%。樹脂骨架：（1）苯乙烯型離子交換樹脂（2）丙烯酸型陽離子交換樹脂（3）多乙烯多胺一一環(huán)氧氯丙烷樹脂（4）聚乙烯砒啶系離子交換樹脂（5）其他離子交換樹脂蛇籠樹脂選擇性離子交換樹脂熱再生離子交換樹脂3、離子交換的選擇性的因素：一、離子化合價與水合半徑的影響二、離子化合價與離子濃度的影響三|、交換環(huán)境的影響（1）溶液的pH（2）離子強度（3）有機溶劑四、樹脂結(jié)構(gòu)的影響（1）樹脂載體交聯(lián)度（2）輔助力（3）其他結(jié)合力五、偶極離子排斥作用。4、偶極離子的交換特點：凈電荷為零時，正電中心和負電中心并不重疊，遂成偶極。鈉型樹脂，被吸附的氨基酸的羧基所帶的負電荷與樹脂磺酸基的負電荷產(chǎn)生排斥力。偶極離子的排斥作用，所以使樹脂對氨基酸的吸附量大大降低。僅供個人學習參考氫型樹脂：由于氨基酸的解離度低，被取代之氫離子為羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶極，故與樹脂磺酸基沒有排斥力。偶極離子的排斥力隨氨基酸的R基碳鏈的加長而減弱。適當增加溶液中離子強度，偶極排斥力減弱。5、大孔、均孔樹脂的特點：大孔型離子交換樹脂的特征：1載體骨架交聯(lián)度高，有較好的化學和物理穩(wěn)定性及機械強度。2孔徑大，不受環(huán)境條件的影響，動力學性能好，抗污染能力強，交換速度快。3表面積大，表面吸附能力強，對大分子物質(zhì)的交換容量大4孔隙率大，比重大，對小離子的體積交換量比凝膠型樹脂小。均孔樹脂的特點：主要為陰離子交換樹脂，骨架的交聯(lián)度比較均勻，孔徑大小一致，重量和體積交換容量都較高，膨脹度、相對密度適中、機械強度好、抗污染和再生能力強。6、離子交換纖維素的特點及洗脫。離子交換纖維素為開放的長鏈骨架，大分子物質(zhì)能自由地在其中擴散和交換，親水性強，表面積大，易吸附大分子；交換基團稀疏，對分子的實際交換容量大；吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；分辨率強，能分離復雜的生物大分子混合物。洗脫：對離子交換纖維素進行吸附后的洗脫一般比從離子交換樹脂的洗脫緩和。升高環(huán)境的pH或是降低環(huán)境的pH或增加離子強度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來。7、酸堿性蛋白選擇合適的離子交換纖維素。酸性蛋白質(zhì)（等電點約pH5），作為一個陰離子，它的DEAE-纖維素柱層析可在pH5。5?9。0之間進行，蛋白質(zhì)和交換劑都是解離的，帶有相反的電荷。在CM-纖維素上層析則需限制在（PH3.5?4.5）之間。堿性蛋白質(zhì)（等電點約pH8）作為一個陽離子，用羧甲基纖維素層析可在pH3.~7.5進行。8、離子交換聚焦色譜的原理：僅供個人學習參考（1）pH梯度的形成：色譜聚焦利用離子交換劑本身的帶電基團的緩沖作用，當洗脫緩沖液不斷滴到離子交換柱上時，柱內(nèi)自動形成pH梯度。（2）蛋白質(zhì)的色譜行為：蛋白質(zhì)所帶電荷取決與他們的等電點和介質(zhì)的pH.當介質(zhì)的pH低于它的等電點時，蛋白質(zhì)帶正電荷，它不與陰離子交換劑結(jié)合，隨洗脫液向下移動。（3）聚焦效應：當一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等電點處，移動速度明顯減慢。加上相同的第二個樣品，它將以洗脫液移動的速度下降，，直到追到正在慢移的第一個樣品成分處（聚焦）。然后這兩個樣品一起下移，往柱下一起洗脫出來。所有的樣品必須在第一個樣品峰尚未被洗脫前加入。9舉例三種常用離子交換樹脂和離子交換纖維素。大孔型強酸型離子交換樹脂大孔型弱酸型離子交換樹脂大孔型弱堿型離子交換樹脂甲基磺酸纖維素乙基磺酸纖維素二乙基氨基乙基纖維素芐基化的DEAE纖維素10、術(shù)語：CM-C：羧甲基纖維素。DEAE-C：=乙氨基乙基纖維素。PBE94：多緩沖交換劑尼柯爾斯方程：m1（1/z1）/m2（1/z2）=Kc1<1/z1>/c2<1/z2>..交換容量：meq/g（毫克當量/克樹脂）樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理過程。偶極離子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所帶的負電荷與樹脂之負電荷產(chǎn)生排斥力。蛇籠樹脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型陰離子交換樹脂中聚合而成的一類樹脂。第九章親和層析1、親和層析原理，主要特點。利用生物體中多數(shù)大分子物質(zhì)具有與某些相應的分子專一型可逆結(jié)合的特性。僅供個人學習參考主要特點：經(jīng)過一此簡單的處理就可以獲得所需的高純度活性物質(zhì)。對設備要求不高，操作簡便，使用范圍廣，特異性強，分離速度快，分離效果好，分離條件溫和。缺點是吸附劑的通用性較差。2、選擇配基的注意點：（1）配基與配體由足夠大的親和力（2）配基與配體的結(jié)合應是專一的（3）配基應具有化學活性。3、手臂，其長短與親和層析的效果的聯(lián)系，為什么。由于酶的活性中心常是埋藏在其結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，它們與介質(zhì)的空間障礙影響其與親和配基的結(jié)合作用。在載體和配基之間插入手臂，以消除空間障礙，手臂的長度是有限的，太短不能起消除空間障礙的作用，太長會使非特異性性吸附增加。4、制作高親和力的親和吸附劑:提高親和層析效果，固定相的配基和流動相的配基具有較強的親和力。配基濃度對親和力的影響。為了將親和配體和其他物質(zhì)分開，在實際親和層析時，通常需要阻流值三10?？臻g障礙的影響：插入適當長度的手臂。配基與載體的結(jié)合位點的影響。載體孔徑的大小對吸附劑的親和能力有決定性的作用。微環(huán)境的影響，包括載體及手臂的電性、極性、次級鍵對配基親和力的影響。5、非專一性吸附包括那些：如何克服。親和層析中的非專一性吸附有以下情況：（1）離子情況（2）疏水基團a長的烴類結(jié)構(gòu)的“手臂”b疏水性配基（3）復合親和力確定離子強度以獲得良好的分離效果6、親和層析洗脫方法：（1）非專一性洗脫改變洗脫劑的pH以影響電性基團的解離程度而洗脫（2）特殊洗脫（3）專一性洗脫競爭性效應非競爭性效應反競爭性效應7、二次作用親和沉淀:利用在物理場（如pH、離子強度、溫度和舔加金屬離子等）改變時溶解度下降，發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和沉淀介質(zhì)。親和介質(zhì)結(jié)合目的分子后，通過改變物理場使介質(zhì)與目標分子共同沉淀的方法。僅供個人學習參考8、親和膜分離原理及特點：親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。優(yōu)點：（1）傳質(zhì)阻力小，達到吸附平衡的時間短，配基利用率高。（20壓降小，流速快，設備體積小，配基用量低。缺點：理論塔板很低，吸附和清洗率低。9術(shù)語：親和力：配基對互補分子間的作用力，是制備高效親和柱的重要參數(shù)。親和吸附劑:載體一一配基。配基：在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。阻流值：Ve/Vo。正洗脫：吸附提取物中的有效成分。負洗脫：去處提取物中的雜質(zhì)。金屬螯合層析：利用金屬離子的絡合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。有機染料親和層析：有機染料如蒽醍化合物和偶氮化合物具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)，一些需要核酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對這些染料具有一定的親和力，將這些染料共價偶聯(lián)到纖維素或瓊脂等多糖載體上，就制得親和層析柱。親和錯流過濾：（affinitycrossflowfiltration）ACFF將親和層析與超濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。親和萃?。豪门悸?lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行目標產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和作用下促進目標產(chǎn)物在PGE相（上相）的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。親和反膠團萃?。菏侵冈诜茨z團相中除通常的表面活性劑（如AOT）外，舔加另一種親水頭部為目標分子的親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標分子的親和結(jié)合作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團萃取分離的選擇性。第十章離心技術(shù)僅供個人學習參考1、相對離心力：(此尸)離心力與重力的比值。用符號“Xg”或“g”表示。RCF=11.18X106N2r(Xg)2、離心機轉(zhuǎn)子有幾種，各自特點。(1)角度轉(zhuǎn)子：機械強度高，重心低，運轉(zhuǎn)平穩(wěn)，壽命長，管內(nèi)溫度分布均勻，溫差對流小，離心時間短，使用方便，但離心管外壁易產(chǎn)生強烈對流和渦流，同時管外側(cè)會出現(xiàn)沉淀，形成壁效應。(2)水平轉(zhuǎn)子：結(jié)構(gòu)復雜，加工困難，機械強度低，重心高，容量小，低速運轉(zhuǎn)時易搖擺，離心時間長，壽命短而價格高。對流作用小，“壁效應”弱。(3)區(qū)帶轉(zhuǎn)子：Anderson轉(zhuǎn)子，無離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個扇形室。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。配有附屬設備和儀器，操作過程復雜，設備較貴，但離心機使用效率高。(4)垂直管轉(zhuǎn)子：特殊類型的定角轉(zhuǎn)子。離心時的碰撞及溫差引起的對流不顯著。顆粒沉降時間短，可用于差速、密度梯度及等密度離心，用于平衡等密度離心時效果最佳。(5)連續(xù)離子轉(zhuǎn)子：低速或高速離心機轉(zhuǎn)子，可用于超速離心機。結(jié)構(gòu)簡單，低速時加樣，高速時排出清夜。用于實驗室，也可用于小規(guī)模生產(chǎn)，最適宜自培養(yǎng)液中收集菌體及細胞。(6)細胞洗脫轉(zhuǎn)子：低速離心時連續(xù)分離型轉(zhuǎn)子，最高轉(zhuǎn)速不超過6000r/min。最適于自動植物培養(yǎng)液或發(fā)酵液中連續(xù)分離單細胞和菌體，回收濃度及回收率均較高。3、速度區(qū)帶離心的特點及其用途：離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分通過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達到其等密度區(qū)之前即停止離心。僅供個人學習參考速度區(qū)帶離心的特點：（1）樣品加于梯度介質(zhì)的頂步、離心時間需嚴格控制。（2）介質(zhì)的密度需嚴格掌握：梯度最大值W組分最小密度（3）樣品的密度（梯度密度最小值（4）分離依據(jù)是各組分之沉降系數(shù)差（5）分辨率受組分沉降系數(shù)、離心時間、顆粒擴散系數(shù)、介質(zhì)黏度及梯度范圍和形狀的影響。本法適于分離顆粒大小不同而密度相近的組分，如DNA與RNA混合物、核蛋白體亞單位及線粒體、溶酶體及過氧化酶體。4、差分離心的特點、用途。原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場中沉降速度的差異進行離心分離。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。5、密度梯度的設計包括：（1）密度梯度介質(zhì)的選用（2）梯度的密度范圍（3）梯度的形狀（4）梯度的容量、（5）直線型梯度的斜率6、“密度梯度”通常的制備方法：（1）不連續(xù)梯度的制備、（2）混合梯度法（3）離心平衡法7、梯度的取出與收集的方法：（1）底部穿刺法（2）頂步收集法取代法虹吸法（3）切割法凍結(jié)切割法聚合切割法8術(shù)語區(qū)帶轉(zhuǎn)子：Anderson轉(zhuǎn)子，無離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個扇形室。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。角度轉(zhuǎn)子：定角轉(zhuǎn)子速度區(qū)帶離子法：離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分通過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達到其等密度區(qū)之前即停止離心。僅供個人學習參考差分離心：差速離心。原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場中沉降速度的差異進行離心分離。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。等密度離心法：離心平衡法，在離心力的作用下，不同密度的多組分顆粒在梯度介質(zhì)中“向上”或“向下”移動。當移動至其密度與介質(zhì)密度相等的位置便不再移動，形成靜止區(qū)帶，即達到離心平衡。第十一章過濾和膜分離技術(shù)用于制作透析膜的材料所應具有的特點：在使用的溶劑介質(zhì)中能形成具有一定孔徑的分子篩樣薄膜。由于介質(zhì)一般為水，所以膜材料應具有親水性，它只允許小分子溶質(zhì)通過。在化學上呈惰性。不具有與溶質(zhì)、溶劑起作用的基團。有良好的物理性能。包括一定的強度和柔韌度，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重復使用。2、透析裝置的類型：（1）旋轉(zhuǎn)透析器（2）平面透析器（3）連續(xù)透析器（4）淺流透析器3、克服濃差極化現(xiàn)象的措施：克服極化的主要措施有振動、攪拌、錯流、切流等技術(shù)，但應注意過于激烈的措施易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活。此外，將某種水解酶類固定于膜上，能降解造成極化現(xiàn)象的大分子，提高流速。不過這種措施沒有通用性，只適用于一些特殊情況。4、實驗用超濾器的類型：（1）無攪拌式裝置（2）攪拌或振動式裝置（3）小棒超濾器（4）淺道系統(tǒng)超濾裝置5、膜孔徑檢測技術(shù)：（1）氣泡壓力法D=4Kocos9/P修正為：D=4o/P僅供個人學習參考（2）水流量法：將濾膜以蒸餾水完全潤濕，裝于濾器中，下接抽氣瓶。開動真空泵，使壓力穩(wěn)定于700mmHg柱，然后加入潔凈蒸餾水100ml，記錄下抽濾100ml水所需要的時間。計算孔徑：r=kS工（其中r——濾膜孔隙半徑，cm;K——0.265;S——膜的厚度，水\GPtmm;V——蒸餾水體積，ml;G——干濕膜重量差，g;P——壓力差，dyn/cm2;t——時間，s。）（3）細菌過濾法6、超濾技術(shù)及優(yōu)點。超濾技術(shù)是一項分子級薄膜分離手段。它以特殊的超濾膜為分離介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為推動力，將不同分子量的物質(zhì)進行選擇性分離。優(yōu)點：沒有相轉(zhuǎn)移，無需舔加任何強烈化學物質(zhì)，可以在低溫下操作，過濾速度較快，便于做無菌處理等。使分離操作簡化，避免生物活性物質(zhì)的活力損失和變性。7術(shù)語超濾：以特殊的超濾膜為分離介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為推動力，將不同分子量的物質(zhì)進行選擇性分離?？紫堵剩何⒖诪V膜孔隙總體積與濾膜總體積之比各向異性膜：在厚度方向上物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的膜。濃度極化現(xiàn)象：超濾在外壓作用下進行。外源壓力迫使分子量較小的溶質(zhì)通過薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐漸形成濃度梯度。水流量法：將濾膜以蒸餾水完全潤濕，裝于濾器中，下接抽氣瓶。開動真空泵，使壓力穩(wěn)定于700mmHg柱，然后加入潔凈蒸餾水100ml，記錄下抽濾100ml水所需要的時間。氣泡壓力法：在多孔板上加3?5mm深的水或其他液體。在容器處于密封狀態(tài)下引入壓縮空氣，使桶內(nèi)壓力緩慢上升。當膜面出現(xiàn)第一個氣泡，記下壓力計讀數(shù)，將此壓力換算成dyn/cm2，進行計算。僅供個人學習參考第十二章制備高效液相色譜HPLC的組成部分：進樣器、高壓泵、預柱、色譜柱、柱頭、檢測器理論塔板數(shù)及分離度的計算公式：理論塔板數(shù)N：n=5.54（）2At12分離度Rs：R= 晨1一分2、-kw）+（W）］2b1b23、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)：分離度（resolution）、分離速度（speed）、回收率（「?。0丫0可）、樣品容量（capacity）主要考慮樣品容量、回收率、和產(chǎn)率。4、蛋白質(zhì)分離的依據(jù)：蛋白質(zhì)的疏水性、分子的大小、等電點。5、色譜介質(zhì)按分離機理分為：液固色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜、離子交換色譜、離子對色譜、凝膠色譜、疏水色譜、親和色譜、聚焦色譜、金屬螯合親和色譜6、 制備型HPLC與分析型HPLC的主要不同點參數(shù)分析型制備型柱內(nèi)徑（mm）2-5>10柱填料30、5、10Hm全多孔或30um薄殼型10、50um全多孔流動相流速（ml/min）~1>10流動相線速度（cm/s）0.1~10.01?0.5樣品體積（Ul）<200>1000要求的檢測靈敏度高低僅供個人學習參考注射的樣品量（mg）<0.5>1007、 術(shù)語塔板理論：塔板理論把色譜柱看作一個分餾塔，有如下基本假設：（1）色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔板組成。在柱內(nèi)每層塔板內(nèi)部，組成能夠在流動相和固定相中達到平衡。（2）流動相通過色譜柱呈間歇式前進運動，每次前進為一個塔板體積。（3）樣品和流動相同時加在第一個塔板上，且樣品垂直于前進方向的擴散（縱向擴散）可以忽略。（4）分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。速率理論：在低流速時增加流速，峰變銳，柱效增加；當超過一定流速時峰變鈍，柱效降低。用塔板高度H對載氣流量u作圖為二次曲線，曲線最低點對應的塔板高度最小，柱效最高，此時流速為最佳流速Q(mào)最佳）其數(shù)學表達式為H=A+B/u+Cu容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動相中的總摩爾數(shù)之比。k'==t' . ' 0選擇因子：表示柱對難分離物質(zhì)的選擇性的好壞。a=上k\綜合表達式：R」（七1）（-k-）N2，4a 1+k;第十三章生化藥物生化藥物的特點及主要資源。（主要資源：（1）氨基酸類藥物（2）多肽與蛋白質(zhì)類（3）核酸類藥物（4）酶類藥物（5）糖類藥物（6）脂類藥物（7）維生素及輔酶類藥理學特性：（1）藥理活性高（2）治療的針對性強，治療的生理、生化機制合理，療效可靠。（3）毒副作用較少，營養(yǎng)價值高。（4）生理副作用常用發(fā)生。僅供個人學習參考理化特性：（1）生物材料中的有效物質(zhì)含量低，雜質(zhì)種類多且含量相對較高。（2）生物活性物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)復雜、穩(wěn)定性差。（3）生物材料易染菌，腐敗。（4）生物藥物制劑的特殊要求。氨基酸的生產(chǎn)方法及各自特點（1）水解法最早發(fā)展起來生產(chǎn)氨基酸的方法，以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸。水解、分離、結(jié)晶。（2）發(fā)酵法：微生物通過固氮作用，硝化還原及外界吸收氨使酮酸氨基化成相應的氨基酸。（3）酶轉(zhuǎn)化法：反應大多在水溶液中進行，條件溫和、選擇性高、副產(chǎn)物少、生產(chǎn)工藝簡單，分離精制容易。（4）化學合成法：以石油化工產(chǎn)品為原料，價格低廉，成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。3、簡述用酶轉(zhuǎn)化法由反丁烯二酸生產(chǎn)天冬氨酸，丙氨酸的過程和所用的關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶：固定化天冬氨酸酶、固定化L-Asp-B-脫羧酶簡述氨基酸輸液的組方原理和原則，常用的氨基酸輸液的類型。組方的原理和原則：（1）所供氨基酸除質(zhì)量要合格外，尚需根據(jù)組合原理確定氨基酸的比例及組成。（2）在氨基酸輸液里，含必需氨基酸的同時，加入恰當組成的非必需氨基酸。必需氨基酸（E）與非必需氨基酸（N）之比一般在1：1或1：3之間。（3）在輸液中通常加入山梨醇或木糖醇，作為添加劑。常見的氨基酸輸液的類型：（1）氨基酸營養(yǎng)輸液（2）代血漿用輸液（3）止血用氨基酸輸液（4）嬰幼兒用氨基酸輸液（5）治療用氨基酸輸液多肽類藥物及蛋白質(zhì)類藥的分類。僅供個人學習參考多肽類藥物的分類:（1）多肽激素①垂體多肽激素②下丘腦激素③甲狀腺激素④胰島激素⑤胃腸道激素⑥胸腺激素（2）多肽類細胞生長調(diào)節(jié)因子表皮生長因子（EGF）轉(zhuǎn)移因子（TG）4鈉素（ANP）（3）含有多肽成分的其他生化藥物血活素胚胎素蛇毒等。以生物組織為原料提取純化多肽和蛋白質(zhì)，在選擇材料及選擇分離純化方法時注意點：材料選擇：（1）種屬（2）發(fā)育生長階段（3）生物狀態(tài)（4）原料來源（5）原料解剖血部位分離純化方法：1根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同來純化蛋白質(zhì)2根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀和大小的不同來純化蛋白質(zhì)3根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同來純化蛋白質(zhì)4根據(jù)蛋白質(zhì)電離性質(zhì)的不同來純化蛋白質(zhì)5根據(jù)蛋白質(zhì)功能專一性的不同來純化蛋白質(zhì)6根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團與相應的載體基團結(jié)合來純化蛋白質(zhì)7根據(jù)蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)種分配的不同來純化蛋白質(zhì)8根據(jù)蛋白質(zhì)的選擇性吸附性質(zhì)來純化蛋白質(zhì)9根據(jù)蛋白質(zhì)的某些特殊性質(zhì)進行純化純化注意點：（1）分離純化早期使用方法的選擇2各種分離純化方法的使用順序3分離純化后期的保護性措施4對分離純化每一步驟的優(yōu)劣進行綜合評價酸醇提取法以胰臟為原料生產(chǎn)胰島素的工藝工藝流程：2.3?2.6倍的86%?88%乙醇（W/W）和5%草酸提取一用pH8.0?8.4濃氨水堿化，用硫酸酸化pH3.6?3.8-減壓濃縮，蒸去乙醇一去脂、27%（W/V）固體氯化鈉鹽析一精制一除酸性蛋白質(zhì)一鋅沉淀一結(jié)晶一回收重組DNA技術(shù)制造人胰島素的兩途徑。僅供個人學習參考AB鏈合成法：以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因，分別插入克隆載體質(zhì)粒所攜帶的B-半乳糖苷酶基因中，再將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌，在細胞中進行復制，并在B-半乳糖苷酶基因的信號序列的控制下，合成mRNA,再翻譯出A鏈和B鏈蛋白，用澳化氟（CNBr）將A鏈和B鏈聯(lián)接起來組成人胰島素。反轉(zhuǎn)錄酶法：通過胰島素原的cDNA合成人胰島素。先將mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶處理合成cDNA,用化學合成法把甲硫氨酸密碼子@16）接在胰島素原cDNA的5,末端，再將此基因插入PBR322質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中增殖，連接物蛋氨酸使胰島素原從融合的蛋白質(zhì)中釋放出來。胰島素原折疊成三維結(jié)構(gòu)，并形成二硫物，再經(jīng)工具酶切開，除去C-肽，即可獲得人胰島素。在多肽的固相合成方法中，常用的氨基保護劑有：（1）Boc（叔丁氧羰基）（2）Fmoc（9-笏甲氧羰基）熟悉多肽的固相合成方法的過程首先將一個用Fmoc基團對a-氨基進行保護的氨基酸通過一個支臂連接到一個不溶性載體上，隨后將a-氨基脫保護，用溶液洗滌氨基酸一支臂一樹脂。將第二個預先活化的a-氨基保護的氨基酸通過偶連反應連接上來。此外，也可以用a-N端及側(cè)鏈保護的肽片段代替單個的氨基酸進行偶聯(lián)反應，縮合反應完成后，用溶液洗滌，重復進行脫保護、偶聯(lián)、直到得到目的肽，最后將肽一支臂一樹脂一裂解。這種延長肽鏈的固相合成法既可采用間斷的方法，也可使用連續(xù)流動的方法。依據(jù)結(jié)構(gòu)特點及臨床應用核酸類藥物分類：（1）具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)，有助于改善機體的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復。有ATP、輔酶A、脫氧核苷酸等。僅供個人學習參考（2）天然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸結(jié)構(gòu)類似物或聚合物，用于人類治療病毒、腫瘤、愛滋病等，產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的抑制物質(zhì)。如：疊氮胸苷、環(huán)腺苷酸等。12、用營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)核苷及核苷酸的原理和方法。13、依據(jù)功效和臨床應用酶類藥物分類酶類藥物：依照其功效和臨床應用分類（1）消化酶類胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等（2）消炎（抗炎）、粘痰溶解酶類胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、膠原酶、50口、菠蘿蛋白酶、溶菌酶、玻璃酸酶、DNase（3）循環(huán)酶類抗凝酶：鏈激酶、尿激酶、纖溶酶..止血酶：人凝血酶、蛇毒凝血酶、促凝血酶原激酶..血管活性酶：激肽釋放酶、彈性蛋白酶（4）抗腫瘤酶天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶（5）其它生理活性酶青霉素酶、尿酸酶、細胞色素C14、從生物材料中提取酶的主要過程和分離純化過程中應注意的問題酶的純化：凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化注意兩個問題：1.建立快速的測定酶活力的方法2.建立活力回收表酶的分離純化工作中的注意事項：1.防止酶蛋白變性2.防止復因子丟失3.防止酶被蛋白水解酶降解15、CuZn-SoD和Mn-SoD的生產(chǎn)工藝及測定方法。（1）以牛血紅細胞提取Cu、Zn-SOD的工藝：僅供個人學習參考【溶血】Hp30min新鮮牛血【收集】1紅細胞【洗滌】一干凈紅細胞離心 2%NaCl【溶血】Hp30min溶血液【去血紅蛋白［ 上清【分級沉淀】A沉淀液【溶解】一上清液乙醇，氯仿，離心 丙酮 H2D,離心【熱變性】 -SOD粗提液【策】一濃縮液【柱層析】一60~70℃,10min,離心 濃縮 DEAE6ephadexA50【洗脫】 【超濾】 【凍干】1、k吸附柱 洗脫濃縮液 凍干粉pH7.6的2.5~50mmol/LPBS（2）以牛肝為原料提取Mn-SOD的工藝16、粘多糖的特點粘多糖：是指含有氨基糖與糖醛酸或它的衍生物的多糖。（1）粘多糖基本上是由特殊的重復雙糖單位構(gòu)成，在此雙糖單位中包括一個N-乙酰氨基己糖（2）粘多糖的組成結(jié)構(gòu)單位中有兩種糖醛酸。即D-葡萄糖醛酸和L-艾杜糖醛酸；有兩種氨基己糖，即：氨基-D-葡萄糖和氨基-D-半乳糖。（3）粘多糖中還有若干其它單糖作為附加成分，如半乳糖等17、多糖結(jié)構(gòu)和多糖活性的關(guān)系（1）多糖的高級結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系（2）多糖的分支度及其側(cè)鏈與生物活性的關(guān)系（3）多糖的分子量與活性的關(guān)系右旋糖苷：Mw10萬?20萬。紅細胞聚集。Mw2萬?4萬紅細胞解聚，治療血栓。（4）多糖中的取代基與生物活性的關(guān)系乙?；焊淖兌嗵堑亩ㄏ蛐院蜋M次性..硫酸基：抗凝血…抗病毒（包括抗艾滋病病毒）：a多糖本身結(jié)構(gòu)（均一多糖）b分子量c硫酸基團的含量18、鹽解一離子交換法生產(chǎn)肝素的工藝19、術(shù)語僅供個人學習參考生化藥物：(biopharmaceutics)是利用生物體、生物組織、細胞或其成分，綜合應用生物學與醫(yī)學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的原理與方法加工制造而成的一大類用于預防、診斷、治療和康復保健的制品。粘多糖：是指含有氨基糖與糖醛酸或它的衍生物的多糖。多糖一級結(jié)構(gòu)：通常指糖基的組成，糖基排列順序，相鄰糖基連接方式，異頭物構(gòu)型，糖基有無分支，分支的位置與長短以及糖基上羥基的取代情況等第十四章微生物藥物B-內(nèi)酰胺類抗生素，氨基糖苷類抗生素，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素以及四環(huán)類抗生素結(jié)構(gòu)上特點，熟悉代表品種的理化性質(zhì)。(1)8-內(nèi)酰胺類抗生素：B-內(nèi)酰胺類抗生素是一類在結(jié)構(gòu)上具有B-內(nèi)酰胺環(huán)(B-lactam)，呈抗菌活性的天然的或化學改造的化合物的總稱。青霉素的基本母核為B-內(nèi)酰胺環(huán)核睡唑烷環(huán)并聯(lián)組成的N-?；?6-氨基青霉烷酸，其側(cè)鏈上的R基可為不同基團取代。青霉素是弱酸性物質(zhì)，易溶于醇類、酮類、醚類和酯類溶劑中，其游離酸在水中的溶解度很小，但其金屬鹽類易溶于水，而幾乎不溶于乙醚、三氯甲烷和醋酸丁酯。工業(yè)上利用此原理，通過將青霉素G游離酸與醋酸鉀反應生成鉀鹽，使之從醋酸丁酯相中析出，可得到高純度的青霉素G鉀鹽。青霉素是不穩(wěn)定的化合物，它在水溶液中極易被破壞而失活，溫度升高或在酸、堿性條件下分解更快。頭抱菌素C為兩性化合物，分子中有2個羧基和一個氨基，pK值分別為<2.6(側(cè)鏈羧基)、3.1(核羧基)、9.8(側(cè)鏈NH3),在中型和偏酸性下呈酸性，能與堿金屬結(jié)合生成鹽類。其鈉鹽含2個結(jié)晶水，為白色或淡黃色結(jié)晶性粉末，易溶于水，不溶于有機溶劑。對稀酸及重金屬離子均穩(wěn)定，水溶液pH>11時迅速失活。僅供個人學習參考（2）氨基糖苷類抗生素:氨基糖苷類抗生素失在分子中含有氨基糖苷結(jié)構(gòu)的一大類抗生素。它們的化學結(jié)構(gòu)都是以氨基酸醇與氨基酸縮合而成的苷，其名稱應為氨基糖苷-氨基環(huán)醇類抗生素。鏈霉素是由鏈霉胍同鏈霉糖和葡萄糖胺衍生物所構(gòu)成的糖苷。其分子中含胍基，呈強堿性，比較穩(wěn)定，易溶于水，難溶于有機溶劑。鏈霉素鹽酸易溶于甲醇，難溶于乙醇，而硫酸鹽即使在甲醇中也很難溶解。硫酸卡那霉素為白色或類白色粉末，無臭，味苦，有吸濕性。易溶于水，在乙醚或三氯甲烷中幾乎不溶，不溶于乙醇、丙酮、苯及醋酸乙酯。在pH2?11范圍內(nèi)較穩(wěn)定，在pH6?8加熱煮沸時，活力可維持30min;加熱至120℃1h,活力僅破壞5%，暴露在陽光中變黑，但對效價沒有影響。（3）大環(huán)內(nèi)酯類抗生素:大環(huán)內(nèi)酯抗生素是以一個大環(huán)內(nèi)酯為母體，通過羥基，以苷鍵和1?3分子糖相連的一類抗生素物質(zhì)。紅霉素14元環(huán)是白色或類白色的結(jié)晶，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、三氯甲烷、酯類、微溶于乙醚。溶解度在55℃時為最小。在室溫和pH6?8條件下其水溶液最穩(wěn)定。麥迪霉素16元環(huán)內(nèi)酯抗生素，白色結(jié)晶性粉末，無臭、有苦味，易溶于甲醇、乙醇、丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯等溶劑，極微溶于水，不溶于石油醚及正己烷，在水中的溶解度隨溫度的升高而降低。在pH2.0?9.0之間的水溶液中最穩(wěn)定，遇堿水解產(chǎn)生丙酸，遇酸水解產(chǎn)生氨基碳霉糖。對熱、濕、光穩(wěn)定。（4）四環(huán)類抗生素:四環(huán)類抗生素系以四并苯（萘并萘）為母族的一族抗生素。固體四環(huán)類抗生素很穩(wěn)定。四環(huán)類抗生素的水溶液在不同pH下穩(wěn)定性差別大。四環(huán)類抗生素對各種氧化劑，包括空氣中的氧氣在內(nèi)，都是不穩(wěn)定的。其堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變黑形成黑色色素。四環(huán)類抗生素在弱酸性溶液中比較穩(wěn)定。四環(huán)類抗生素能和很多高價金屬離子如鈣離子、鎂離子等形成螯合物，這一性質(zhì)用僅供個人學習參考于從發(fā)酵液中提取四環(huán)素。四環(huán)類和尿素形成等摩爾比復合物，不溶于水，當溶于有機溶劑時，復合物即分離成四環(huán)素和尿素。微生物藥品的一般分離純化過程：預處理和過濾一交換洗脫、萃取一精制一脫色、結(jié)晶一洗滌、干燥熟悉幾大類抗生素制備工藝的一般流程，掌握其工藝要點。P577-P592a.青霉素：性質(zhì)很不穩(wěn)定，提煉過程應在低溫、快速、嚴格控制pH下進行，注意對設備清洗消毒減少污染，盡量避免青霉素效價的破壞損失。工藝要點：發(fā)酵液預處理和過濾一萃取一脫色和脫水一結(jié)晶一洗滌干燥b.頭抱菌素C：工業(yè)上主要采用多種分離純化方法相結(jié)合的生產(chǎn)工藝，先用大孔網(wǎng)狀吸附劑從發(fā)酵液中初步分離出頭抱菌素C,然后經(jīng)離子交換法純化，最后采用絡鹽沉淀法進行結(jié)晶。工藝要點：預處理一大孔網(wǎng)狀吸附劑的吸附與解吸一離子交換樹脂的純化一沉淀結(jié)晶c.鏈霉素：提取目前均采用離子交換法、二次洗脫工藝要點：預處理及過濾一交換和洗脫一精制一脫色、干燥d.卡那霉素：采用強酸型陽離子樹脂進行提純濃縮。工藝要點：預處理一樹脂洗脫一脫色一粗制一精制e.紅霉素：溶劑萃取法和大孔樹脂吸附法工藝要點：發(fā)酵液的預處理和過濾一吸附一洗滌、解吸一反萃取一結(jié)晶f.麥迪霉素：它在不同的酸堿度溶解在不同溶劑中的特性，以丁酯和酸性水溶液反復萃取，最后轉(zhuǎn)入酸型水相，pH調(diào)至堿性，析出麥迪霉素游離堿，經(jīng)洗滌干燥后即得成品。僅供個人學習參考g.四環(huán)素：工藝要點：酸化過濾一粗品結(jié)晶一溶解一連續(xù)結(jié)晶一分離洗滌一氣流干燥一尿素復鹽結(jié)晶一溶解一結(jié)晶一分離洗滌一固定床氣流干燥根據(jù)給定藥物的性質(zhì)，