第一節(jié)核酸的分離純化

分子生物學(xué)研究之所以從20世紀(jì)中葉開(kāi)始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增等核心技術(shù)當(dāng)前1頁(yè)，總共44頁(yè)?；蚬こ陶Q生的基礎(chǔ)1、理論上的三大成就2、技術(shù)上的二大發(fā)明當(dāng)前2頁(yè)，總共44頁(yè)。三大成就

：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)當(dāng)前3頁(yè)，總共44頁(yè)。2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一張能反映DNA美麗雙螺旋結(jié)構(gòu)的X射線照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins當(dāng)前4頁(yè)，總共44頁(yè)。Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科學(xué)家因?yàn)閷?duì)這一成果的貢獻(xiàn)，共享1962年的諾貝爾生物學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)前5頁(yè)，總共44頁(yè)。ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway當(dāng)前6頁(yè)，總共44頁(yè)。3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。JacobandMonod當(dāng)前7頁(yè)，總共44頁(yè)。但是，如果沒(méi)有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。

當(dāng)前8頁(yè)，總共44頁(yè)。兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶（DNAligase）當(dāng)前9頁(yè)，總共44頁(yè)。一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，

獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)前10頁(yè)，總共44頁(yè)。HerbertBoyer,StanleyCohen1972年獲得第一個(gè)重組DNA分子(實(shí)現(xiàn)不同來(lái)源DNA的重組)HerbertBoyer當(dāng)前11頁(yè)，總共44頁(yè)。1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA當(dāng)前12頁(yè)，總共44頁(yè)。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies當(dāng)前13頁(yè)，總共44頁(yè)。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來(lái)的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。當(dāng)前14頁(yè)，總共44頁(yè)。Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。當(dāng)前15頁(yè)，總共44頁(yè)。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。當(dāng)前16頁(yè)，總共44頁(yè)。

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線當(dāng)前17頁(yè)，總共44頁(yè)。分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）當(dāng)前18頁(yè)，總共44頁(yè)。第一節(jié)核酸的分離純化當(dāng)前19頁(yè)，總共44頁(yè)。主要內(nèi)容

前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細(xì)胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的濃度測(cè)定（五）核酸的保存當(dāng)前20頁(yè)，總共44頁(yè)。

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言當(dāng)前21頁(yè)，總共44頁(yè)。一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性

1意義遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。

2分離核酸原則：

1）溫度不要過(guò)高；

2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定的離子強(qiáng)度;

4）減少物理因素對(duì)核酸降解的機(jī)械剪切力.當(dāng)前22頁(yè)，總共44頁(yè)。（二）防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。當(dāng)前23頁(yè)，總共44頁(yè)。1DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。當(dāng)前24頁(yè)，總共44頁(yè)。2RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。當(dāng)前25頁(yè)，總共44頁(yè)。

(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）劇毒。當(dāng)前26頁(yè)，總共44頁(yè)。（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)當(dāng)前27頁(yè)，總共44頁(yè)。二分離提取核酸的主要步驟（一）細(xì)胞的破碎

1高速組織搗碎機(jī)搗碎

2玻璃勻漿器勻漿

3超聲波處理法

4液氮研磨法

5化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）

6生化法（溶菌酶、纖維素酶等）當(dāng)前28頁(yè)，總共44頁(yè)。（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，同時(shí)避免核酸降解。當(dāng)前29頁(yè)，總共44頁(yè)。常用方法：

1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)的功能；

當(dāng)前30頁(yè)，總共44頁(yè)。

3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。當(dāng)前31頁(yè)，總共44頁(yè)。

1）使用注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。

2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意當(dāng)前32頁(yè)，總共44頁(yè)。（三）核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。當(dāng)前33頁(yè)，總共44頁(yè)。1核酸沉淀的鹽類及濃度當(dāng)前34頁(yè)，總共44頁(yè)。2有機(jī)沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：

對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：

需要量大，一般要求低溫操作。當(dāng)前35頁(yè)，總共44頁(yè)。（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。當(dāng)前36頁(yè)，總共44頁(yè)。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。當(dāng)前37頁(yè)，總共44頁(yè)。（4）精胺

精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開(kāi)，達(dá)到純化DNA的目的。當(dāng)前38頁(yè)，總共44頁(yè)。3核酸沉淀的溫度和時(shí)間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。當(dāng)前39頁(yè)，總共44頁(yè)。(四）核酸的濃度測(cè)定

1紫外分光光度法測(cè)定DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。當(dāng)前40頁(yè)，總共44頁(yè)。DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1μg/ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD260＝0.02

當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg/ml

ssDNA濃度約為37μg/ml

RNA濃度約為40μg/ml

當(dāng)前41