基于DNA技術(shù)的紅細(xì)胞血型檢測(cè)及其應(yīng)用策略

目前已經(jīng)命名的所用紅細(xì)胞血型系統(tǒng)ISBT迄今為止共確定、命名了30個(gè)血型系統(tǒng)（001～030），300多個(gè)血型抗原，1188個(gè)等位基因。其中血型系統(tǒng)抗原262個(gè)，集合抗原、低頻抗原和高頻抗原40個(gè)。ISBT系統(tǒng)名稱發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)符號(hào)抗原數(shù)基因符號(hào)等位基因數(shù)001002003004005006007008009010011012013014015016017018019020021022023024025026027028029ABOMNSPRhLutheranKellLewisDuffyKiddDiegoYtXgSciannaDombraockColtonLandsteiner-winerChido/RodgersHhKxGerbichCromerKnopsIndianOKRaphJMHIGlobosideGIL19011926192619391945194619461950195119551956196219621965196719401967195219751960196519701974197919871999199319981995ABOMNSP1RHLUKELLEFYJKDIYTXGSCDOCOLWCH/RGHXKGECROMKNINOKRAPHJMHIiGLOBGIL44315320276632122453391171282111111ABOGYPA.GYPB.GYPEP1RHD.RHCE,RHAGLUKELFUT3,FUT6,FUT7FYJKAEIACHEXGSCDOAQPILWC4A.C4BFUTI,FUT2XKGYPCDAFCRICD44OKMER2SEMA7AIGnT,GCNT2B3GALNT1AQP31584333119,42,13173617、2111878491083734、3232913〉302538992（一）血型的基因基本被染色體定位和克隆測(cè)序ABO 9q34.2MNS 4q28-31P 22q13.2Rh 1p36.1-34Lutheran 19q12-13Kell 7q33Lewis 19p13.3Duffy 1q22-23Kidd 18q11-12Diego 17q12-21Yt 7q22Xg Xp22.32Scianna 1p36.2-22.1Landsteiner-winerChido/RodgersHhKxGerbichCromerKnopsIndianOKRaphJMHIGlobosideGIL19p13.26p21.319q13.3Xp21.12q14-211q321q3211p1319p13.311p15.515q22.3-236p24.23q26.19p13.3Dombraock 12p13.3-13.2Colton 7p14Rh-associated

glycoprotein6p21-qter二、紅細(xì)胞血型分子生物學(xué)研究進(jìn)展（二）血型基因的組成已基本被闡明30個(gè)血型系統(tǒng)的血型基因已經(jīng)被認(rèn)定、克隆、測(cè)序。ABO、Lewis、H、I、Globoside和P基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，這些糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成糖脂和糖蛋白上的寡多糖。其它28個(gè)基因編碼表達(dá)在紅細(xì)胞表面的蛋白抗原。（三）血型多態(tài)性抗原分子基礎(chǔ)基本被闡明單核苷酸取代（單核苷酸多態(tài)性SNP）：外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子多核苷酸取代外顯子取代單核苷酸缺失多核苷酸缺失外顯子缺失基因缺失單核苷酸插入多核苷酸插入外顯子重復(fù)基因轉(zhuǎn)換或基因重組???????????基因突變突變（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改變。1）點(diǎn)突變（point

mutation）：?jiǎn)螇A基置換。? 同義突變（same

sense

mutation）:

氨基酸無(wú)改變，無(wú)突變效應(yīng)。? 錯(cuò)義突變(missense

mutation)：新密碼子，氨基酸序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。? 無(wú)義突變(non-

sense

mutation)：變成終止密碼，合成不完整多肽產(chǎn)生突變效應(yīng)。終止密碼突變（terminator

codon

mutation)：合成過(guò)長(zhǎng)的多肽，產(chǎn)生突變效應(yīng)。? 移碼突變（frame-shift

mutation)：DNA鏈中插入1個(gè)或幾個(gè)單堿對(duì)，使突變處以下部位密碼發(fā)生變化，使合成的氨基酸種類或序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。2）片段突變：DNA鏈中小片段單堿序列發(fā)生缺失、重復(fù)或

重排，產(chǎn)生突變效應(yīng)。117ABO血型抗原多態(tài)的分子基礎(chǔ)（多堿基取代、單堿基缺失）ABO261 297G A526 657 703 796 803 930C C G C G G精176甘 亮 甘235 266 268G GGTAACAnt261GdeletionACCGCGG甘絲蛋丙176235266268O1nt261GdeletionACCGCGG117TACCGT

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GGC

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GTG半異亮絲絲丙cEGC C A

ACCCECT A G

GTCCysIleSerSerPro48G150C178C201

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A307C676Gce色亮天東脯丙166068103226Exon-1Exon-2Exon-5Exon-1Exon-2Exon-5Exon-1Exon-2Exon-5TrpLeuAsnproPro166068103226Exon-1Exon-2Exon-5MN2TTA亮12TCA絲11415GGT甘5谷51415GAGMN血型物質(zhì)是一種富含唾液酸糖蛋白，被稱為唾液酸糖蛋白（sialoglycoprotein）或血型糖蛋白A（glycophorins

A,GPA）。GPA由131個(gè)氨基酸殘基組成

。M與

N的堿基差異為在第2、14、15發(fā)生3個(gè)堿基替換，導(dǎo)致第1、5氨基酸M抗原為絲、甘，N抗原為亮、谷。MNSs血型抗原及分子基礎(chǔ)

（1）MNSs血型抗原及分子基礎(chǔ)

（2）Ss蛋29蘇29143TSs血型物質(zhì)是GPB。GPB是另一個(gè)富含唾液酸紅細(xì)胞膜糖蛋白，在結(jié)構(gòu)上與GPA密切相關(guān)。GPB由72個(gè)氨基酸殘基組成。S/s多態(tài)性表現(xiàn)在第29位氨基酸的替換。143C基因雜交GYPA的第3外顯子與GYPB的第3外顯子（假外顯子）部分雜交形成表型Mur。血型抗原不表達(dá)的常見(jiàn)機(jī)制：1、基因缺失2、移碼突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止信號(hào)3、剪切位點(diǎn)核苷酸取代4、啟動(dòng)子核苷酸取代5、基因交換或基因轉(zhuǎn)換6、基因融合7、

假基因GATA

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李劍平三、血型分子生物學(xué)研究的意義1、解決了很多懸而未決或有爭(zhēng)議的問(wèn)題2、有助于更好地研究紅細(xì)胞抗原功能3、有助于人類學(xué)、疾病相關(guān)性等研究4、為開(kāi)展血型基因分型（分子檢測(cè)）奠定基礎(chǔ)解決了很多懸而未決或有爭(zhēng)議的問(wèn)題（1）Rh血型的遺傳模式Fisher遺傳模式Wiener遺傳模式（2）類N特異性（3）解決有爭(zhēng)議的親權(quán)關(guān)系O型父親和AB型母親可以生出AB型的孩子嗎？O型父親和O型母親可以生出A型孩子嗎？O型父親和B型母親可以生出A型的孩子嗎？M型父親和N型母親能生出N型孩子嗎？OOO

AhOAAOHAOO cisAB/OcisAB/OABOHcisABMMg

NNNMgNM

gN解釋OOOBOOAAAv解釋四、紅細(xì)胞血型基因分型方法4、紅細(xì)胞血型常用基因分型方法PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSPPCR-SSOPCR-SBT? 基因芯片限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法restriction

fragment

lengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸序列的變異，使DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位產(chǎn)生、消失或移位，致使酶切片段長(zhǎng)度和/或數(shù)量發(fā)生變化而呈現(xiàn)的DNA多態(tài)性。?FYA

240bp 213bp 107bp 109bp????FYB453bpBanI的酶切識(shí)別點(diǎn)為

GGPyPuCC。FYB被BanI切成長(zhǎng)分別為453bp，107bp和109bp的三條短片斷；因?yàn)镕YA是FYB在第42密碼子發(fā)生A→G突變進(jìn)化而來(lái)[4]，所以FYA較FYB多一個(gè)酶切點(diǎn)，被切成長(zhǎng)度分別為240bp，213bp，107bp和109bp的四條短片斷（見(jiàn)圖1）。PCR-RFLPPCR單鏈構(gòu)型多態(tài)性PCR-single

strandconformation

polymorphism,

PCR-SSCP基本原理：PCR產(chǎn)物熱變性后形成單鏈DNA，在非變性凝膠中，因DNA片段堿基排列順序的不同，單鏈DNA形成不同的（空間構(gòu)型，導(dǎo)致電泳遷移率的差別而呈現(xiàn)多態(tài)性，根據(jù)譜帶的位置判定型別。PCR-SSCP解鏈原

理DAN單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，其遷移率不僅與鏈長(zhǎng)有關(guān)，還與單鏈

DNA的空間構(gòu)象有關(guān)，因此堿基變異引起的構(gòu)象變化也可改變單鏈DNA的電泳遷移率。利用這種原理可將野生型DNA和突變型DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。CCGCCGAGTACTGGAACAGCaTACCGTAAGGGCGGCTCATGACCTTGTCGGGGTATACCTAGCCGCCGAGTACTGGAACAGCbTACCGTAAGAGCGGCTCATGACCTTGTCGGGGTATACCTAGSequence-Specific

Primer(

Allele-Specific

Primer)

PCRMNMN Marker序列（等位基因）特異性寡核苷酸探針雜交分析法Sequence(allele)

specificoligonucleotide,S(A)SO根據(jù)鹼基互補(bǔ)的原則,制備識(shí)別特定寡核苷酸序列的單鏈DNA探針,并標(biāo)記示蹤物,在高強(qiáng)度條件下與變性DNA樣品雜交,檢測(cè)示蹤物,陽(yáng)性者為檢出相應(yīng)的等位基因。相關(guān)概念：A：雜交：兩條異源寡核苷酸單鏈按照鹼基互補(bǔ)的原則復(fù)性為雙鏈的過(guò)程。B：探針：標(biāo)記有示蹤物，能夠識(shí)別靶核苷酸序列并與之退火雜交的具有以知序列的寡核苷酸單鏈。探針的條件A:長(zhǎng)度為20bp左右。B：具備高度特異性。C：容易標(biāo)記示蹤物。D：在雜交過(guò)程中本身性質(zhì)穩(wěn)定。TGGCATCACGGGCATCASO探針?lè)ā疎-1曹,E,,’1·11...

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&bioarray)技術(shù)：根據(jù)生物分子間特異性相互作用，

將生化分析過(guò)程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等各

種生物成分的高通量快速檢測(cè)分析。將大量靶基因片段有序地、高密度地（點(diǎn)與點(diǎn)間距小于500um）排列在載體上，通過(guò)熒光標(biāo)記的探針雜交，計(jì)算機(jī)掃描分析獲取數(shù)據(jù)，是一種快速、高效、高通量分析生物信息的工具，特別適用于一次性進(jìn)行大量靶基因的雜交探測(cè)。DNA序列測(cè)定DNA

sequencing雙脫氧鏈終止法Dideoxy

chain

terminationHO::HOBaseHHHHOOPOOHOBaseHHHHOOPOOHCGCTTACGCAGGTGTTGCGATGTCCAC五、紅細(xì)胞基因分型應(yīng)用策略血清學(xué)方法PK基因分型方法中國(guó)蜻血靠草

20-07

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匍向

，認(rèn)為

血型血清

豐落伍

了

，技

術(shù)

落后

了

，不

需要

研究

了

，只有

DNA

檢

測(cè)才

上“檔

次”，才

有

科

技含

量

，時(shí)

鼓

忽視血

型血清學(xué)基本理論

、實(shí)掛

方

法的普及

和提

高

，惠略血

型血

清

學(xué)

的研究和臨庫(kù)需

要

，這種

脫離實(shí)

際

味求“新飛

在“

深”的頓

向甚

至

有向基層

血站和醫(yī)院

輸血科

夏延之

勢(shì)，影

響

了輸血學(xué)

科

的建

設(shè)發(fā)展和臨

＊用

血的安

全由技術(shù)取代不

了交叉

配血技

術(shù)，也不會(huì)普

遍用于常規(guī)

工作

？因?yàn)?/p>

與

血清

學(xué)技

術(shù)

相比

，基

因掛

測(cè)

所

需

時(shí)

間

長(zhǎng)

、操作復(fù)雜

，且缺乏標(biāo)

準(zhǔn)品

，易受

多精因

素干擾

，如

引物設(shè)計(jì)『合成

等

。忽視血型血清

學(xué)研究

，

味追求基

因檢測(cè)

的現(xiàn)

象影

響輸血學(xué)

的學(xué)科建設(shè)，潛在

威

NJ.用血安全曲

例

如，現(xiàn)在剛踏人輸血

事

業(yè)

的技

術(shù)人

員就沒(méi)有全面系

統(tǒng)學(xué)

習(xí)血型血清學(xué)理論和技

術(shù)的機(jī)會(huì)和條件

，些Where

are

,ve,

and

,vhere

are

we

.going,

with

DNA-

based

approaches

i:n

immunohematolo白帶

Is

serology

且nished?George

Garratty口

問(wèn)temb

2006

I

副tendworkshop

or’ganized

by

the

Food

and

Drug

Administration

(FDA)

I

Cet】ter

for

Biologics

Evaluatim】

and

Resear’ch’

Dep盯ttnent

ofHealth

and

Hun1an

Sendces/0伍ce

of

Pub]ic

Heε11th

andScience,

and

the

National

Institutes

of

Health/

NationalH劇時(shí)，Lung

,

and

Blood

Institute.

The

workshop

、ws

on

Mo]ecu]ar

Methods

in

Im1nunohematofogy.

A

ve血a.tiln

report

is

available

on

the

web

(ht甲：Ih.V\/

cberIefoiltninutes.hnn)

.Iam

not

experienced

in

mo]ecu］缸

biology,

but

duringthelast

decade

it

has

become

increasingly

obvious

to

1ne

that

the

application

of

deoxyl'ibonucleic

acid

(DNA)

-

based

techno]ogy

is

going

to

change

allour

Lives.

As

an

Associate

巴ditor

of

τRANSFU

SION,

I

receive

most

of

the

artides

concen1ing

胞d

blood

cell

(RBq

in1munohematol

-

ogy.

Since

the

beginning

of

this

new

centu盯在

the

number

of

atik]es

involving

DNA-based

technology

has

been

inc皿asing

every

ye缸’

（e.g..

in

2006.,

55

per’cent

of

themanaging

the

availability

and

usage

of

components

of

rare

blood

叩pes:genotypi口g

multiply

transfused

recipients

,

p副ients

with

severe

thromboc嚴(yán)openia，四d

those

whose

RBCs

or

p]atelets

are

sensitized

v1,ith

antibodies;resohdng

ABO

and

RhD

discrepandes;identi