酶工程-酶分子定向進(jìn)化

酶工程_酶分子定向進(jìn)化第一頁，共73頁。酶分子定向進(jìn)化酶分子定向進(jìn)化又稱為酶分子體外進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，是蛋白質(zhì)工程的新策略，是在試管中模擬達(dá)爾文進(jìn)化的過程，利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變體。與傳統(tǒng)的理性設(shè)計相比，它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，產(chǎn)生基因多樣性，并結(jié)合定向篩選（或選擇）技術(shù)，獲得具有某些預(yù)期特征的改構(gòu)酶。第二頁，共73頁。

生物的自然進(jìn)化進(jìn)化過程：突變→自然選擇→遺傳后代進(jìn)化結(jié)果：

基因多樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的多個基因或同一個基因(同源性)

代謝途徑的多樣性：同樣產(chǎn)物，多條途徑

代謝產(chǎn)物的多樣性：同一底物，不同產(chǎn)物

生物多樣性：整個生態(tài)系統(tǒng)中的生物第三頁，共73頁。酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(rationaldesign)酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)第四頁，共73頁。酶的合理設(shè)計第五頁，共73頁。體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。第六頁，共73頁。定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的第七頁，共73頁。DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exonshuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進(jìn)行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。第八頁，共73頁。定向進(jìn)化的選擇策略1、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。高通量的篩選體系第九頁，共73頁。酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯PCRβ-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN′穩(wěn)定性盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機(jī)相活性易錯PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變β-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達(dá)DNA改組酶的體外定向進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例回本章目錄第十頁，共73頁。分子進(jìn)化工程的種類第十一頁，共73頁。人工獲取新基因的方法常規(guī)的基因工程方法生物功能蛋白質(zhì)基因新基因的理性設(shè)計和人工合成

根據(jù)已有基因的序列和功能進(jìn)行設(shè)計基因的直接進(jìn)化（directedevolution)

可使已有基因獲得新的特性可獲得自然界中不存在的基因可解決許多新的理論和應(yīng)用問題第十二頁，共73頁?；蛑苯舆M(jìn)化的用途提高酶活性——天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構(gòu)體選擇性——酯酶可水解非天然酯類改善酶的工藝性——冷適應(yīng)和熱適應(yīng)酶改變酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)——二體酶變?yōu)閱误w酶獲取許多新的理論知識第十三頁，共73頁。基因直接進(jìn)化的用途提改變酶的特性----多功能或單功能酶高酶活性---天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構(gòu)體選擇性----酯酶可水解非天然酯類改變酶的工藝性----冷適應(yīng)和熱適應(yīng)酶改善酶的穩(wěn)定性----二體酶變?yōu)閱误w酶或單體酶變?yōu)槎w酶獲取許多新的理論知識第十四頁，共73頁。TLPs的失活曲線第十五頁，共73頁。TLP-ste突變蛋白的三維結(jié)構(gòu)第十六頁，共73頁。酶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化第十七頁，共73頁。蛋白質(zhì)的耐熱機(jī)制天然耐熱蛋白質(zhì)特性：

減少內(nèi)腔體積；引入鹽橋束；減少表面積/體積比；除去氧化還原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支鏈氨基酸；除去能脫氨基的氨基酸。所有耐熱蛋白質(zhì)的氨基酸同源性低至36%，最高不超過75%。分子進(jìn)化耐熱蛋白質(zhì)特性：

鄰-硝基苯酯酶（p-nitrobenzylesterase）突變體8g8的了穩(wěn)定性提高了17C，但突變的氨基酸數(shù)僅有13個，與天然酯酶同源性高達(dá)97%。第十八頁，共73頁?；蛑苯舆M(jìn)化的步驟突變基因突變庫的建立篩選

基因突變庫的活體或離體篩選基因復(fù)制與遺傳第十九頁，共73頁。建立基因突變庫的方法定向誘變：點(diǎn)突變——堿基刪除、增補(bǔ)和替換隨機(jī)誘變：

易錯PCR法(Error-pronePCR)——降低一種dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP來代替被減少的dNTP緩沖液中另加0.5mmol/LMn2+第二十頁，共73頁。第二十一頁，共73頁。易錯PCR

第二十二頁，共73頁。同序法（consensusapproach）對一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較，以一定的標(biāo)準(zhǔn)程序計算出各氨基酸序列的共有序列；人工合成同序基因后重組表達(dá)。MartinLehmann等（2000～2002）把這種方法應(yīng)用在真菌植酸酶家族設(shè)計合成了同序植酸酶基因，并表達(dá)出具熱穩(wěn)定性的同序植酸酶。第二十三頁，共73頁。真菌植酸酶aa序列的同序比較

第二十四頁，共73頁。同序植酸酶-1的最適溫度為71℃，而親代植酸酶的最適溫度為45-55℃，增加了16-26℃,同序植酸酶-1Tm為78℃，比親代植酸酶增加了15-22℃，而催化性質(zhì)與大多數(shù)親本植酸酶相似。第二十五頁，共73頁。DNAShuffling:外顯子、單基因和基因家族的重組裝隨機(jī)引物延伸法交錯延伸法隨機(jī)片段活體突變:

線狀基因和隨機(jī)片段共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞第二十六頁，共73頁?；蛲蛔儙斓暮Y選方法ScreeningtheLibraryandSelectingtheRightClone

平板分析使抗生素失效的酶類(如頭孢菌素酶，b

-乳糖酶）提高耐熱性易于觀察的菌落表型（如菌落顏色等）營養(yǎng)缺陷型的輔助篩選第二十七頁，共73頁。噬菌體展示、細(xì)胞表面展示根據(jù)所需要的特性，對經(jīng)Shuffling后的DNA文庫在噬菌體或細(xì)菌細(xì)胞表面（細(xì)菌、纖毛蟲細(xì)胞表面）的表現(xiàn)特征進(jìn)行篩選，獲得提高目的底物親和力的突變子。減少篩選工作量突變文庫→大的突變子庫→小的突變子庫→單克隆第二十八頁，共73頁。噬菌體表面展示(phagesurfacedisplay)將外源基因或隨機(jī)序列的DNA分子群與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達(dá)在噬菌體外殼表面的方法。易于用免疫反應(yīng)或配體特異性結(jié)合等方法篩得目的克隆。第二十九頁，共73頁。噬菌體展示篩選模式第三十頁，共73頁。DNAShuffling技術(shù)DNAShufflingDNA改組DNA洗牌DNA攪亂重排1994年，Stemmer等，用DNAShuffling技術(shù)體外快速進(jìn)化蛋白——有性PCR法1997年，F(xiàn)ranceAronld研究組將DNAShuffling技術(shù)做了改進(jìn)——交錯延伸法第三十一頁，共73頁。WhathappensafterDNAshuffling

Generationofalargelibraryofnovelgenes(chimeras)Selectionforimproved/desiredbio-functions

crossovers,deletions,insertions,inversions,

pointmutationsDarwinianEvolution

NaturalselectionofexistingmutationsDirectedEvolution

TargetedselectionofcreatedmutationsWhatisDNAshuffling?DNAShuffling的內(nèi)涵第三十二頁，共73頁。DNAShuffling：指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。通過改變單個基因(或基因家族，genefamily)原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。DNAShuffling的內(nèi)涵第三十三頁，共73頁。項目進(jìn)化速度進(jìn)化對象進(jìn)化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個基因組多年完整基因組高DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組低DNAShuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較第三十四頁，共73頁。HowDNAshufflingworks-1HowDNAshufflingisdoneinthetube

Randomfragmentationofapoolofrelatedgenes;Self-primingpolymerasereactionandtemplateswitching(causingcrossovers);PCRamplificationwithprimersofreassembledproducts

第三十五頁，共73頁。HowDNAshufflingworks-2Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis...........SinglegeneshufflinglibraryofpointmutantsFamilygeneshufflinglibraryofchimerasGeneratingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences第三十六頁，共73頁。DNA重組裝的過程第三十七頁，共73頁。隨機(jī)引物PCR和重組裝第三十八頁，共73頁。第三十九頁，共73頁。連續(xù)易錯PCR(sequentialerrorpronePCR)策略即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。第四十頁，共73頁。易錯PCR方法第四十一頁，共73頁。交錯延伸PCR突變法第四十二頁，共73頁。磷脂酶熱穩(wěn)定－催化活性的分子進(jìn)化（JaeKwangSong等，2000）DNAShuffling技術(shù)的應(yīng)用第四十三頁，共73頁?？莶輻U菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化（HuiminZhao等，1999）第四十四頁，共73頁。進(jìn)化后的枯草桿菌蛋白酶E正面反面第四十五頁，共73頁。耐熱p-硝基苯酯酶的分子進(jìn)化(LoriGiver等，1998）第四十六頁，共73頁。β-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mary′aJesu′sArrizubieta等，2000）第四十七頁，共73頁。部分DNAShuffling技術(shù)的研究成果類型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域蛋白綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度45基礎(chǔ)研究重組蛋白RecA重組率100基礎(chǔ)研究抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥第四十八頁，共73頁。綠色熒光蛋白（greenfluorescenceprotein;GFP;greenfluorescentprotein）從水母(Aequoreavictoria)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，是主要發(fā)光的位置。其發(fā)光團(tuán)的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因。第四十九頁，共73頁。

2008年諾貝爾化學(xué)獎得主2008年的諾貝爾化學(xué)獎授予了從事有關(guān)“綠色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),表達(dá)和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學(xué)家:下村修、馬丁·查爾菲和錢永健。第五十頁，共73頁。

熒光蛋白在三大領(lǐng)域“發(fā)光”

目前，熒光蛋白在很多領(lǐng)域都發(fā)揮著重大作用，包括有毒物質(zhì)檢測、神經(jīng)生物分析及轉(zhuǎn)基因動物研究等。比如，可用熒光蛋白檢測水井中是否含有砷(俗稱砒霜)。砷中毒問題在東南亞地區(qū)較為嚴(yán)重，常使很多人集體中毒。研究人員已經(jīng)研發(fā)出帶有熒光蛋白的抗砷性細(xì)菌，只要水中含有砷，細(xì)菌就會發(fā)出熒光并被儀器檢測到，提醒人們不要飲用。GFP還可用作檢測TNT(一種烈性炸藥)、重金屬等。熒光蛋白在神經(jīng)生理學(xué)上的應(yīng)用也很受人關(guān)注，在它的幫助下，研究人員能看到以前所不能見的新世界，包括大腦神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程和癌細(xì)胞的傳播方式等。熒光蛋白的另一種重要應(yīng)用就是轉(zhuǎn)基因動物。近年來，美國、韓國、日本等國曾多次培養(yǎng)出“發(fā)光的動物”，我國也在去年12月首次培養(yǎng)出綠色熒光轉(zhuǎn)基因豬。轉(zhuǎn)基因動物是指，將一種動物基因在另一種動物體內(nèi)表達(dá)的過程，在遺傳研究、器官移植、特種改良等領(lǐng)域具有重大意義。熒光蛋白由于結(jié)構(gòu)簡單可作為“報告基因”(一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因)，大大簡化了轉(zhuǎn)基因動物的培養(yǎng)過程。

第五十一頁，共73頁。Random-primingrecombination(RPR)隨機(jī)引物重組法第五十二頁，共73頁。隨機(jī)挑取枯草桿菌蛋白酶RPR庫中10個克隆序列第五十三頁，共73頁。DNA重組裝原理圖(DNAshuffling)1.DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；2.隨機(jī)片段變性；3.隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長DNA片