微生物發(fā)酵制藥工藝課件

第2章微生物發(fā)酵制藥工藝

1本章內(nèi)容2.1微生物發(fā)酵與制藥2.2制藥微生物生長(zhǎng)特征2.3制藥微生物菌種的建立2.4培養(yǎng)基制備2.5滅菌工藝2.6微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7發(fā)酵工藝過(guò)程的控制2.8抗生素生產(chǎn)工藝2.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10維生素生產(chǎn)工藝22.1微生物發(fā)酵與制藥31發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過(guò)微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過(guò)程。發(fā)酵種類(lèi)：用產(chǎn)品說(shuō)明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。初級(jí)代謝產(chǎn)物：在初級(jí)代謝過(guò)程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長(zhǎng)所必須的。幾乎所有生物初級(jí)代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機(jī)酸。次級(jí)代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，對(duì)生命活動(dòng)有意義（抗逆境條件）。抗生素，毒素，色素。52、發(fā)酵制藥概念利用制藥微生物的生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過(guò)程6抗生素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家FlemingB發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)青霉素。在20世紀(jì)40年代，一共發(fā)現(xiàn)了14種抗生素，50年代發(fā)現(xiàn)了20余種，60年代開(kāi)始了化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的合成和半合成抗生素階段。目前發(fā)現(xiàn)并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬(wàn)種以上。但實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用的只有100余種。7制藥微生物的種類(lèi)生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌和絲狀真菌三大類(lèi)。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類(lèi)抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線(xiàn)菌主要產(chǎn)生各類(lèi)抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類(lèi)（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類(lèi)（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線(xiàn)菌素類(lèi)（放線(xiàn)菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（制霉菌素、抗滴蟲(chóng)霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類(lèi)或簡(jiǎn)單的氧雜環(huán)類(lèi)，多為酸性化合物。93發(fā)酵制藥的基本過(guò)程菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實(shí)驗(yàn)室、種子庫(kù)發(fā)酵車(chē)間提煉車(chē)間包裝車(chē)間102.2微生物的生長(zhǎng)特征11發(fā)酵前期特征從接種至菌體達(dá)到一定臨界濃度的時(shí)間，包括延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗，減少生長(zhǎng)特征：菌體不斷地生長(zhǎng)和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時(shí)，濃度最低。pH變化：先升后降－先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機(jī)酸，后又被利用。13幾個(gè)概念1延遲期

延滯期（lagphase）或適應(yīng)期是指接種后，菌體的生物量沒(méi)有明顯增加的一段時(shí)間。延遲期是菌體適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程。延遲期時(shí)間長(zhǎng)短不一，與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，由菌體與環(huán)境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現(xiàn)不同。工業(yè)上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近，對(duì)數(shù)期的菌體作為種子、加大接種量等方法進(jìn)行放大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。

2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（logphase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現(xiàn)對(duì)數(shù)速度增長(zhǎng)的過(guò)程。特點(diǎn)是生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，并保持不變。細(xì)胞的化學(xué)組成與生理學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。菌體生長(zhǎng)不受限制，細(xì)胞分裂繁殖和代謝極其旺盛?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞組分恒定，菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與生物量是一級(jí)動(dòng)力學(xué)關(guān)系

143減速期

減速期(declinephase)是指菌體生長(zhǎng)速率下降的一段時(shí)間。由培養(yǎng)基中基質(zhì)濃度下降，有害物質(zhì)積累等不利因素引起。在減速期內(nèi)，生長(zhǎng)速率與菌體濃度仍符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)關(guān)系，但受基質(zhì)濃度限制。一般生物的減速期較短。

15發(fā)酵后期特征菌體衰老，細(xì)胞開(kāi)始自溶的一段時(shí)間合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞菌體自溶給過(guò)濾和提取等帶來(lái)困難。17自溶作用（autolysis）自溶作用是細(xì)胞的自我毀滅（cellularself-destruction），速溶酶體將酶釋放出來(lái)將自身細(xì)胞降解。在正常情況下，溶酶體的膜是十分穩(wěn)定的，不會(huì)對(duì)細(xì)胞自身造成傷害。如果細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，造成溶酶體破裂，那么細(xì)胞就會(huì)在溶酶體酶的作用下被降解，如某些紅細(xì)胞常會(huì)有這種情況發(fā)生。在多細(xì)胞生物的發(fā)育過(guò)程中，自溶對(duì)于形態(tài)建成具有重要作用。18生長(zhǎng)與產(chǎn)物的關(guān)系模型從菌體生長(zhǎng)、能源利用和產(chǎn)物生成速度的變化及其之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系出發(fā)，Gaden把發(fā)酵過(guò)程分為三種模型。19II型：菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型（semi-couplingmodel）。該模型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。產(chǎn)物來(lái)自能量代謝所用的基質(zhì)，但是在次級(jí)代謝與初級(jí)代謝分開(kāi)的。在細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)，基本無(wú)產(chǎn)物生成，在生長(zhǎng)的中后期生成大量的產(chǎn)物而進(jìn)入產(chǎn)物形成期。分批發(fā)酵出現(xiàn)兩個(gè)高峰，先是基質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)的高峰，然后是產(chǎn)物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物也屬于此類(lèi)型。產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：

；

21III型：菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型（non-couplingmodel）。菌體生長(zhǎng)期與產(chǎn)物生成期為獨(dú)立的兩個(gè)階段，先形成物質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)高峰，幾乎沒(méi)有或很少有產(chǎn)物生成，然后進(jìn)入菌體生長(zhǎng)靜止期，產(chǎn)物大量生成，并出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。產(chǎn)物可能來(lái)自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過(guò)程，物質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)之后，菌體利用中間代謝途徑，初級(jí)代謝與產(chǎn)物形成是完全分開(kāi)的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發(fā)酵。對(duì)于誘導(dǎo)型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導(dǎo)物，基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物表達(dá)，所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：

22代謝產(chǎn)物的生物合成代謝（metabolism）是生物體內(nèi)進(jìn)行的生理生化反應(yīng)的統(tǒng)稱(chēng)。代謝分為分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過(guò)程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復(fù)雜大分子的過(guò)程，滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的需要。

初級(jí)代謝是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對(duì)細(xì)胞具有生理活性作用的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的代謝網(wǎng)絡(luò)。在初級(jí)代謝過(guò)程中形成的產(chǎn)物為初級(jí)代謝產(chǎn)物（primarymetabolite），包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級(jí)代謝基本相同。

次級(jí)代謝存在于某些生物中，并在一定時(shí)期表達(dá)。次級(jí)代謝對(duì)正常的生長(zhǎng)可能不必要，但對(duì)抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。23（2）具有種屬特異性，與種屬分類(lèi)學(xué)無(wú)關(guān)。分類(lèi)學(xué)上相同的菌種能產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的抗生素，如灰色鏈霉菌既可以產(chǎn)生氨基環(huán)醇類(lèi)抗生素，又可以產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。分類(lèi)學(xué)上不同的菌種能產(chǎn)生相同結(jié)構(gòu)的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均可產(chǎn)生頭孢菌素C。一種微生物的不同菌株產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同的多種次級(jí)代謝物，而同一菌株會(huì)產(chǎn)生一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物。25（3）生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)向生產(chǎn)期，形態(tài)與生理發(fā)生變化。次級(jí)代謝產(chǎn)物是在細(xì)胞生長(zhǎng)后期開(kāi)始形成，當(dāng)生長(zhǎng)受限制時(shí)被啟動(dòng)。完成菌體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（trophophase）之后，出現(xiàn)次級(jí)代謝物合成期（idiophase），其生物合成比生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境更敏感，要求更高。次級(jí)代謝產(chǎn)物是以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，受到初級(jí)代謝的調(diào)節(jié)?？赡苁侨狈δ撤N營(yíng)養(yǎng)成分，菌體生長(zhǎng)抑制，啟動(dòng)了次級(jí)代謝物合成。菌體內(nèi)中間代謝物積累，抑制了初級(jí)代謝酶，使之消失或活性下降，誘導(dǎo)了新酶的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期。芽孢桿菌形成芽孢，放線(xiàn)菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是細(xì)胞分化的伴隨現(xiàn)象。26次級(jí)代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位微生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物是由微生物代謝產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初級(jí)代謝產(chǎn)物合成。

把構(gòu)成次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)單位稱(chēng)為生源（biogen）。生源直接或間接來(lái)源于次級(jí)代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物或初級(jí)代謝產(chǎn)物。構(gòu)建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類(lèi)、不常見(jiàn)的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇等。

29次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成的基本過(guò)程次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成基本過(guò)程包括構(gòu)建單位的聚合—再修飾—裝配。在此過(guò)程中，次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關(guān)鍵酶活性大小與產(chǎn)量正相關(guān)。30（1）前體聚合微生物合成生源后，通過(guò)縮合反應(yīng)形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。

各種聚酮體的合成過(guò)程相似，只是起始單位和延長(zhǎng)單位不同。聚酮體是2－6個(gè)二碳單位的聚合反應(yīng)的結(jié)果，酮基被保留，或只是還原為羥基。聚酮體可直接形成環(huán)，如四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)。進(jìn)而被修飾，與相應(yīng)基團(tuán)如氨基糖、糖胺等結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再與8個(gè)丙二酰單位縮合形成9酮化合物，再轉(zhuǎn)化為中間體三環(huán)化合物。甲基化、還原、脫水、加氫、氧化形成4氧脫水四環(huán)素，加氯形成4氧脫水氯四環(huán)素，轉(zhuǎn)氨形成4氨基脫水氯四環(huán)素，再甲基化形成脫水氯四環(huán)素，脫氫氯四環(huán)素，最后形成氯四環(huán)素。大環(huán)內(nèi)酯是2－4碳單位縮合而成。

氨基酸的聚合有三種形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化縮合，如谷胱甘肽；蛋白質(zhì)的核糖體模板合成途徑；多酶復(fù)合物將氨基酸活化后，按硫模板或非核糖體機(jī)理縮合，形成肽鏈。氨基酸與ATP反應(yīng)，在羧基上形成腺苷單磷酸酯被激活。氨基酸被轉(zhuǎn)移到酶的巰基上，形成硫酯鍵。硫酯鍵斷裂，提高能量，使2個(gè)氨基酸之間形成肽鍵（羧基與氨基結(jié)合）。依次，形成多肽鏈。如短桿菌肽S是由2條5肽首尾連接而成。31（2）結(jié)構(gòu)修飾包括糖基化、?；?、甲基化、羥基化、氨基化、氧化還原等，使抗生素產(chǎn)生了共存的系列類(lèi)似物。在聚酮體鏈延長(zhǎng)的過(guò)程中，伴隨許多基團(tuán)的化學(xué)修飾，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷鍵與糖類(lèi)物質(zhì)連接，酰胺鍵與氨基酸連接，形成各種抗生素。如四環(huán)素類(lèi)，先形成聚酮體，在C7位發(fā)生氯化則是金霉素，在C5位上先氧化后還原則是土霉素。32（3）裝配合成各個(gè)組分后，需要按一定順序在特異酶作用下組裝，才能形成有活性的藥物。332.3制藥微生物菌種的建立34發(fā)酵生產(chǎn)藥物，需產(chǎn)量高的菌種，自然界中的菌種趨向于快速生長(zhǎng)和繁殖，而發(fā)酵工業(yè)需要大量積累產(chǎn)物，因此菌種選育很重要。常規(guī)方法是利用天然變異，從中選擇優(yōu)良株系。隨后物理因子（紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、中子、激光等）和化學(xué)因子（烷化劑、堿基類(lèi)似物等）和生物因子（噬菌體、抗生素）誘變育種。20世紀(jì)80年代，以原生質(zhì)體融合的雜交育種和基因工程育種，90年代以后，可以用基因組shuffling育種。35新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)育種36微生物藥物與菌種的篩選流程樣品采集微生物分離培養(yǎng)篩選方法學(xué)建立篩選鑒定前藥－新化合物化合物分離純化陽(yáng)性結(jié)果

生產(chǎn)出發(fā)菌菌種鑒定與保藏新化合物新藥研究與開(kāi)發(fā)371、生產(chǎn)菌的自然分離(1)來(lái)源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：80%表層土壤（0－10cm），海洋（0－100m）欲處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性，用物理和化學(xué)的方法處理。（1）溫度；高溫可得到放線(xiàn)菌。（2）SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減少細(xì)菌，有利于放線(xiàn)菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。（3）離心、膜過(guò)濾381、生產(chǎn)菌的自然分離(2)培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)和pH；添加抑制劑。分離方法：（1）稀釋法：無(wú)菌水，生理鹽水，緩沖液（2）濾膜法：0.22－0.45μm。細(xì)菌在膜上，放線(xiàn)菌菌絲可穿透，進(jìn)入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：溫度。放線(xiàn)菌：25－30℃，32－37℃，7－14天至1月；45－50℃，1~2d。39藥物的篩選瓊脂擴(kuò)散法——活性測(cè)定：非致病菌為對(duì)象，耐藥細(xì)菌和厭氧菌的抗生素，篩選生物活性物質(zhì)。HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質(zhì)。靶向篩選高通量篩選高內(nèi)涵篩選

從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)篩選模型，有目的的篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素。高通量篩選是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)樣品檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體系運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。

所謂高內(nèi)涵篩選是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術(shù)層面而言，高內(nèi)涵篩選是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，在細(xì)胞水平上檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù)，旨在獲得被篩樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息。高內(nèi)涵篩選技術(shù)的檢測(cè)范圍包括：靶點(diǎn)激活、細(xì)胞凋亡、分裂指數(shù)、蛋白轉(zhuǎn)位、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

402、菌種選育——自然選育（1）定義：不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過(guò)程。應(yīng)用：（1）菌種的提純復(fù)壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。過(guò)程菌種單孢子平板分離單菌落測(cè)活優(yōu)良菌株效率低,增產(chǎn)幅度小412、菌種選育——誘變育種（2）定義：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個(gè)體，淘汰劣質(zhì)個(gè)體。物理類(lèi)：紫外線(xiàn)，快中子，激光，太空射線(xiàn)?；瘜W(xué)類(lèi)：堿基類(lèi)似物，嵌合劑，亞硝酸。生物類(lèi)：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)單，效益大。缺點(diǎn)：無(wú)定向性。42誘變育種流程出發(fā)菌種單孢子懸液誘變處理高產(chǎn)菌株單菌落初篩稀釋涂板復(fù)篩穩(wěn)定性特性中試放大投入生產(chǎn)432、菌種選育——雜交育種（3）概念：兩個(gè)不同基因型的菌株，通過(guò)結(jié)合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。特點(diǎn)：有一定的定向性。種類(lèi)：準(zhǔn)性生殖接合原生質(zhì)體融合44（1）準(zhǔn)性生殖育種概念：準(zhǔn)性生殖范圍：放線(xiàn)菌，半知菌綱的真菌過(guò)程兩條菌絲相互結(jié)合異核體二倍體重組單倍體產(chǎn)黃青霉：提高青霉素產(chǎn)量對(duì)氟苯丙氨酸灰黃鏈霉菌：灰黃霉素產(chǎn)量

45準(zhǔn)性生殖是指異核體（單個(gè)生物個(gè)體中含有兩種或兩種以上基因型）細(xì)胞中兩個(gè)遺傳物質(zhì)不同地細(xì)胞核可以結(jié)合成雜合二倍體地細(xì)胞核。這種雜合二倍體的細(xì)胞核在有絲分裂過(guò)程中可以發(fā)生染色體和單倍體化,最后形成遺傳物質(zhì)重組的單倍體的過(guò)程。也就是不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂就能導(dǎo)致基因重組的生殖過(guò)程。

46（2）接合育種范圍：細(xì)菌、放線(xiàn)菌過(guò)程：兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)基因片段進(jìn)入另一細(xì)胞合子重組單倍體雖然有成功報(bào)導(dǎo)，但多數(shù)效果不顯著4748（3）原生質(zhì)體融合育種概念通過(guò)生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個(gè)不同種類(lèi)的體細(xì)胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個(gè)親本遺傳性狀的新細(xì)胞.用去壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體，在高滲條件下，用聚乙二醇（PEG）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，再生細(xì)胞壁，從而獲得異核體或重組子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。49503、菌種保藏原因：菌種經(jīng)過(guò)多次傳代，會(huì)發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長(zhǎng)生命時(shí)限，長(zhǎng)期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營(yíng)養(yǎng)；缺乏）51保藏方法低溫斜面保藏：低溫降低新陳代謝。4℃，RH70％以下。短期保藏，1－6個(gè)月；易變異石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發(fā)。4℃，約1年。砂土管保藏：干燥抑制生長(zhǎng)。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數(shù)年。冷凍干燥保藏：保護(hù)劑降低菌體細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶對(duì)細(xì)胞傷害。低溫避光，中期保藏，5～10年。液氮保藏：培養(yǎng)物與冷凍保護(hù)劑混合，密封。液氮（－196℃）罐或－80℃冰箱。低溫、缺氧、避光和營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境。長(zhǎng)期保藏。52保藏機(jī)構(gòu)－中國(guó)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì),下設(shè)9個(gè)庫(kù)中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(CGMCC)，微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團(tuán)抗生素所53小結(jié)生產(chǎn)菌的分離：自然分離與篩選菌種選育：自然選育、雜交育種、誘變育種菌種保藏：低溫、干燥；機(jī)構(gòu)542.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備概念（medium）供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。552.4.1培養(yǎng)基的成分碳源氮源無(wú)機(jī)鹽水生長(zhǎng)因子前體與促進(jìn)劑消泡劑561、碳源(carbonsources)概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動(dòng)和過(guò)程提供能量來(lái)源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。57碳源種類(lèi)糖類(lèi)：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類(lèi)：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類(lèi)：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類(lèi)、有機(jī)酸遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸582、氮源（nitrogensources）概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作用：為生長(zhǎng)和代謝主要提供氮素來(lái)源。種類(lèi)：無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源59有機(jī)氮源幾乎所有微生物都能利用有機(jī)氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素。60無(wú)機(jī)氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業(yè)應(yīng)用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。（NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。613、無(wú)機(jī)鹽和微量元素概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。種類(lèi)：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。624、水菌體細(xì)胞的主要成分。營(yíng)養(yǎng)傳遞的介質(zhì)。良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的主要成分之一。635、生長(zhǎng)因子（growthfactor）概念：維持微生物生長(zhǎng)所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和氮源作用。種類(lèi)：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無(wú)需添加。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。646、前體(precursor)概念：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無(wú)多大的變化。使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。多次少量、連續(xù)流加的工藝。657、促進(jìn)劑(accelerant)概念：促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營(yíng)養(yǎng)物，也不是前體的一類(lèi)化合物。種類(lèi)：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。668、消沫劑（defoamingagent）概念：降低泡沫的液膜強(qiáng)度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類(lèi)：表面活性劑，低表面張力。天然動(dòng)植物油脂類(lèi)、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類(lèi)、聚醚類(lèi)、硅酮類(lèi)）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。672.4.2培養(yǎng)基種類(lèi)及其質(zhì)量控制技術(shù)培養(yǎng)基的種類(lèi)按用途：選擇性、鑒別性、富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過(guò)程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。681、固體培養(yǎng)基概念：（solidmedium）細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。制備：液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0%瓊脂粉。作用：提供菌體的生長(zhǎng)繁殖，形成孢子。691、固體培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制單細(xì)胞培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)豐富，滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無(wú)機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。營(yíng)養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。702、種子培養(yǎng)基概念：（seedmedium）供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。作用：使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長(zhǎng)形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子。712、種子培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制培養(yǎng)基成分必需完全，營(yíng)養(yǎng)豐富。用速效性、容易被利用的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大?？s短發(fā)酵的延滯期。723、發(fā)酵培養(yǎng)基概念：(fermentationmedium)提供微生物生長(zhǎng)、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。作用：不僅要滿(mǎn)足菌體的生長(zhǎng)和繁殖，還要滿(mǎn)足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。733、發(fā)酵培養(yǎng)基－要求營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中。組成上豐富完整。不同菌種和不同產(chǎn)物，對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。744、補(bǔ)料培養(yǎng)基(fedmedium）概念：發(fā)酵過(guò)程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量組成：各種必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基。755、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量（1）控制水質(zhì)：恒定水源和恒定的水質(zhì)。地下深層井水，對(duì)水質(zhì)定期化驗(yàn)檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基措施：檢測(cè)與控制水質(zhì)參數(shù)pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類(lèi)和含量。76（2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量：來(lái)源與種類(lèi)的選擇農(nóng)副產(chǎn)品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大?；瘜W(xué)原料：雜質(zhì)含量也不相同。措施：保持穩(wěn)定的原料來(lái)源。更換原料時(shí)，必需再進(jìn)行一系列試驗(yàn)，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。77原料的選擇試驗(yàn)：不同碳源、氮源對(duì)菌種生長(zhǎng)的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。對(duì)原料進(jìn)行試驗(yàn)，選擇滿(mǎn)足發(fā)酵要求的來(lái)源。注意：碳氮濃度與配比：適宜速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢(shì)pH：配制時(shí)加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩沖劑。78（3）控制培養(yǎng)基的黏度：對(duì)發(fā)酵的影響：高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過(guò)程直接影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)79（4）控制滅菌操作：高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間滅菌，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。802.4.3制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制一般設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)思路計(jì)算與定量配制優(yōu)化811、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)一般原則生物學(xué)原則：根據(jù)不同微生物營(yíng)養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計(jì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當(dāng)。成分之間比例：恰當(dāng)，C/N比適宜。原料之間：不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過(guò)程容易控制。低成本原則：原料來(lái)源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。高效經(jīng)濟(jì)原則：滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。822、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)基本思路起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)和使用。單因素實(shí)驗(yàn)：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。多因素實(shí)驗(yàn)：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。中試放大試驗(yàn)：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個(gè)適宜的生產(chǎn)配方。833、理論計(jì)算與定量配制微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)可用下列表達(dá)式表示：碳源和能源＋氮源＋其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)→細(xì)胞＋產(chǎn)物＋CO2＋H2O＋熱量單位細(xì)胞生物量所需最小的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):單位產(chǎn)量的最小底物濃度:84碳源和氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化率計(jì)算和分析初步計(jì)算：參考微生物的化學(xué)和元素組成。轉(zhuǎn)化率：?jiǎn)挝毁|(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細(xì)胞量。理論轉(zhuǎn)化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算實(shí)際轉(zhuǎn)化率：發(fā)酵過(guò)程中實(shí)際測(cè)量數(shù)值計(jì)算。目標(biāo)：使實(shí)際轉(zhuǎn)化率靠近理論轉(zhuǎn)化率。852.5滅菌工藝滅菌方法與原理培養(yǎng)基滅菌工藝空氣除菌工藝86幾個(gè)概念雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無(wú)害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無(wú)活微生物存在的過(guò)程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。872.5.1滅菌方法與原理1、化學(xué)滅菌2、物理滅菌881、化學(xué)滅菌用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。化學(xué)滅菌劑：氧化劑類(lèi)等，鹵化物類(lèi)，有機(jī)化合物等。機(jī)理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。應(yīng)用：皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠(chǎng)的無(wú)菌區(qū)域的臺(tái)面、地面、墻壁及空間的滅菌。892、物理滅菌各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過(guò)濾等進(jìn)行滅菌紫外線(xiàn)等射線(xiàn)：局部空間干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿蒸汽滅菌：培養(yǎng)基效果好，操作方便，廣泛使用。903干熱滅菌在高溫120℃以上，蛋白質(zhì)、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放，生物體死亡。對(duì)于干熱滅菌，足夠長(zhǎng)的時(shí)間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒(méi)有濕熱滅菌好，是實(shí)驗(yàn)室常用的器皿的方法。工業(yè)采用160℃、2h，或170℃、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時(shí)間相應(yīng)縮短。914蒸汽滅菌濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態(tài)下，穿透力強(qiáng)，蒸汽冷凝時(shí)釋放出大量能量，使蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)部的化學(xué)鍵破壞、降解，導(dǎo)致生物體死亡。一般在115℃～140℃，保持一段時(shí)間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價(jià)格低廉，來(lái)源方便，效果可靠，操作控制簡(jiǎn)便，因此濕熱滅菌常用于培養(yǎng)基和設(shè)備容器的滅菌。常用條件為115℃～121℃，壓力1×105Pa，維持15～30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強(qiáng)，不易殺滅。因此在設(shè)計(jì)滅菌操作時(shí)，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。為了確保徹底滅菌，實(shí)際操作中往往增加50％的保險(xiǎn)系數(shù)。

922.5.2培養(yǎng)基滅菌1、微生物高溫死亡動(dòng)力學(xué)與滅菌的關(guān)系微生物受熱死亡過(guò)程的一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：－dX/dt=kdX微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)。以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。確保徹底滅菌，實(shí)際操作中增加50％的保險(xiǎn)系數(shù)。932、培養(yǎng)基滅菌的操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實(shí)罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。特點(diǎn)：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，手動(dòng)。缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。94分批操作的滅菌過(guò)程95分批滅菌的操作過(guò)程通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無(wú)菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。96（2）連續(xù)滅菌操作高溫短時(shí)滅菌操作，連續(xù)：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過(guò)一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過(guò)程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。97（2）連續(xù)滅菌操作－流程圖

培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（130－140℃）98（2）連續(xù)滅菌－操作過(guò)程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時(shí)間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。99連續(xù)滅菌的特點(diǎn)1）高溫快速滅菌工藝，營(yíng)養(yǎng)成分破壞的少2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對(duì)壓力要求高，一般為0.45-0.8MPa。1002.5.3空氣除菌操作工藝1、發(fā)酵對(duì)空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無(wú)菌空氣。壓強(qiáng)：0.2-0.4MPa?？諝赓|(zhì)量：相對(duì)濕度小于70％；比培養(yǎng)溫度高10－30℃；潔凈度100級(jí)。1012、工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：空氣在進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機(jī)以提高壓力，所以空氣熱滅菌時(shí)所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時(shí)的溫度升高來(lái)實(shí)現(xiàn).靜電除菌：靜電除塵是利用靜電引力來(lái)吸附帶電離子而達(dá)到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒(méi)有電荷的微粒進(jìn)入高壓靜電場(chǎng)時(shí)則會(huì)被電離成帶電微粒，但對(duì)于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當(dāng)產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對(duì)微粒的拖帶力或微粒布朗運(yùn)動(dòng)的動(dòng)量時(shí)，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對(duì)很小的微粒效率較低。介質(zhì)過(guò)濾：是使空氣通過(guò)經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過(guò)濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。1023、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。是依靠氣流通過(guò)濾層時(shí)，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動(dòng)過(guò)程中出現(xiàn)無(wú)數(shù)次改變氣速大小和方向的繞流運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致微生物微粒與濾層纖維間產(chǎn)生撞擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)了過(guò)濾。

103（1）.慣性沖擊滯留作用機(jī)理當(dāng)微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運(yùn)動(dòng)時(shí)，空氣受阻即改變運(yùn)動(dòng)方向，繞過(guò)纖維前進(jìn)，而微粒由于它的運(yùn)動(dòng)慣性較大，未能及時(shí)改變運(yùn)動(dòng)方向隨主導(dǎo)氣流前進(jìn)，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，微粒就滯留在纖維表面上。104（２）、攔截滯留作用機(jī)理

當(dāng)氣流速度下降到一定值時(shí)，若微粒隨氣流慢慢靠近纖維時(shí)，受纖維所阻改變方向，繞過(guò)纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更慢，當(dāng)與纖維表面接觸時(shí)就被捕集。105（３）、布朗擴(kuò)散作用機(jī)理

直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)，稱(chēng)為布朗擴(kuò)散。106（４）、重力沉降作用機(jī)理

重力沉降是一個(gè)穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對(duì)它的拖帶力時(shí)，微粒就容易沉降。107（５）、靜電吸附作用機(jī)理

懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會(huì)受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。108

當(dāng)空氣流過(guò)介質(zhì)時(shí)，上述五種除菌機(jī)理同時(shí)起作用，不過(guò)氣流速度不同，起主要作用的機(jī)理也就不同。當(dāng)氣流速度較大時(shí)，除菌效率隨空氣流速的增加而增加，此時(shí)慣性沖擊起主要作用；當(dāng)氣流速度較小時(shí)，除菌效率隨氣流速度的增加而降低，此時(shí)擴(kuò)散起主要作用；當(dāng)氣流速度中等時(shí)，可能是截留起主要作用。如果空氣流速過(guò)大，除菌效率又下降，則是由于已被捕集的微粒又被湍動(dòng)的氣流夾帶返回到空氣中。

除菌效率109影響深層過(guò)濾效率的因素

微粒大小、過(guò)濾介質(zhì)的種類(lèi)、規(guī)格、介質(zhì)的填充密度、過(guò)濾介質(zhì)層厚度以及所通過(guò)的空氣氣流速度等。1104、空氣過(guò)濾介質(zhì)膜過(guò)濾介質(zhì)：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹(shù)脂微孔濾膜。0.1-0.5um深層過(guò)濾介質(zhì)：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭過(guò)濾紙：超細(xì)玻璃纖維紙(1-1.5um)金屬燒結(jié)管：?jiǎn)胃驇资踔辽习俑饘傥⒖诪V管安裝在過(guò)濾器內(nèi)。1115、空氣滅菌工藝過(guò)程1126過(guò)濾除菌設(shè)備結(jié)構(gòu)一.概述：

提高壓縮前空氣的潔凈度的主要措施：提高空氣吸氣口的位置和加強(qiáng)吸入空氣的前過(guò)濾。113一、空氣預(yù)處理設(shè)備

1．粗過(guò)濾器

安裝在空氣壓縮機(jī)前的粗過(guò)濾器，其主要作用：捕集較大的灰塵顆粒，防止壓縮機(jī)受損，同時(shí)也可減輕總過(guò)濾器負(fù)荷。粗過(guò)濾器一般要求過(guò)濾效率高，阻力小，否則會(huì)增加空氣壓縮機(jī)的吸入負(fù)荷和降低空氣壓縮機(jī)的排氣量。常用的粗過(guò)濾器有：布袋過(guò)濾、填料式過(guò)濾、油浴洗滌和水霧除塵等。1142.設(shè)備結(jié)構(gòu)除塵器

115116117空氣壓縮機(jī)

分為離心式空氣壓縮機(jī)和往復(fù)式空氣壓縮機(jī)兩種?？諝獬谐ニF油霧的原因：否則：（1）導(dǎo)致傳熱系數(shù)降低，給空氣冷卻帶來(lái)困難。（2）如果油霧的冷卻分離不干凈，帶入過(guò)濾器會(huì)堵塞過(guò)濾介質(zhì)的纖維空隙，增大空氣壓力損失。（3）黏附在纖維表面，可能成為微生物微粒穿透濾層的途徑，降低過(guò)濾效率，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)浸潤(rùn)介質(zhì)而破壞過(guò)濾效果。118貯氣罐

貯氣罐的作用：（1）消除脈動(dòng)維持罐壓的穩(wěn)定。（2）使部分液滴在罐內(nèi)沉降。（3）保溫滅菌。119

冷卻器

120油水分離器

121122加熱器

123二級(jí)冷卻器

其結(jié)構(gòu)同一級(jí)冷卻器相同，由于季節(jié)關(guān)系或其它原因?qū)嚎s空氣的冷卻效果達(dá)不到工藝要求的情況下，可增設(shè)二級(jí)冷卻器，再次冷卻。124

通過(guò)油水分離器凈化過(guò)的空氣，仍含有粒度較小的雜質(zhì)及油水霧滴，需在除霧器中進(jìn)一步除去。除霧器結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，為一個(gè)中間夾有填料瓷環(huán)的容器，油水霧滴遇到填料瓷環(huán)便凝聚下來(lái)，最后，可通過(guò)油水排出口排出。除霧器1251262.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條件微生物發(fā)酵工藝過(guò)程的三個(gè)工段：種子制備接種發(fā)酵培養(yǎng)1272.6.1種子制備種子的制備：種子的逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程。獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。1281．孢子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，恢復(fù)其固有生物特性。放線(xiàn)菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。細(xì)菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。1292．生產(chǎn)種子制備搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子。種子罐級(jí)數(shù)：制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級(jí)數(shù)的因素:菌種生長(zhǎng)特性及菌體繁殖速度：生長(zhǎng)快，少發(fā)酵罐的容積：越大，多產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多所選用工藝條件：有利于生長(zhǎng)的工藝，少130發(fā)酵類(lèi)型的定義一級(jí)發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐二級(jí)發(fā)酵：經(jīng)過(guò)一級(jí)種子罐，再到發(fā)酵罐；谷氨酸生產(chǎn)三級(jí)發(fā)酵：二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)四級(jí)發(fā)酵：三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)三級(jí)種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌131接種方式單種法：一個(gè)種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。雙種法：兩個(gè)種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個(gè)發(fā)酵罐。1322.6.2培養(yǎng)技術(shù)1、固體表面培養(yǎng)技術(shù)：Solidsurfaceculture原始，最早采用。2、液體深層培養(yǎng)：Liquidsubmergedculture主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)1333、高密度培養(yǎng)（highcelldensityculture）概念：菌體濃度（干重）至少達(dá)到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標(biāo)和方向。優(yōu)點(diǎn):縮小發(fā)酵體積增加表達(dá)量成本低，生產(chǎn)率高。1342.6.3發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作2、流加式操作，補(bǔ)料－分批式操作3、半連續(xù)式操作，反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)4、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作5、灌流式操作1351、分批式操作概念：培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，一次性接種，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，一次性卸出全部培養(yǎng)物。特點(diǎn)：非衡態(tài)過(guò)程－發(fā)酵體系的組成（基質(zhì)、產(chǎn)物及細(xì)胞濃度）都隨發(fā)酵時(shí)間而變化。缺點(diǎn)：開(kāi)始時(shí)基質(zhì)濃度很高，到中后期，營(yíng)養(yǎng)物濃度很低，產(chǎn)物濃度很高，對(duì)發(fā)酵不利。輔助時(shí)間：清洗罐，裝料、滅菌，時(shí)間長(zhǎng)。1362、流加式操作概念：裝入大部分培養(yǎng)液，一次性接種，在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。特點(diǎn)：流加能源和碳源物質(zhì)及氨水等。克服了批式的缺點(diǎn)，使生長(zhǎng)和生產(chǎn)保持適宜水平。缺點(diǎn)：整個(gè)發(fā)酵體積不斷增加。1373、半連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，一次性接種。間歇取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物（帶放），同時(shí)補(bǔ)充同等數(shù)量的新培養(yǎng)基；然后繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)酵結(jié)束。特點(diǎn)：發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液總體積保持不變使生長(zhǎng)和生產(chǎn)保持適宜水平。缺點(diǎn)：?jiǎn)适Р糠智绑w，喪失部分菌體，利于非生產(chǎn)菌突變株的生長(zhǎng)1384．連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基,同時(shí)取出包括培養(yǎng)液和菌體在內(nèi)的發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束。特點(diǎn)：恒定狀態(tài)的發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)體積及其物系的組成將不隨時(shí)間而變。培養(yǎng)基連續(xù)穩(wěn)定流加；產(chǎn)物連續(xù)穩(wěn)定收獲；提高菌體密度；自動(dòng)化。缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)，雜菌污染、突變機(jī)會(huì)增多。1395、灌流（注）式操作概念：培養(yǎng)液與菌體一起裝入發(fā)酵罐，菌體培養(yǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，取出部分條件培養(yǎng)基，菌體仍然滯留罐內(nèi)。特點(diǎn)：除去有毒害的代謝物補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1402.7發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于:生產(chǎn)菌種性能與合適的環(huán)境條件發(fā)酵過(guò)程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)關(guān)鍵在于過(guò)程檢測(cè)與控制141檢測(cè)儀器與主要參數(shù)原位傳感器：pH，溶氧，溫度，壓力在線(xiàn)儀器：尾氣分析儀離線(xiàn)儀器：基質(zhì)、產(chǎn)物濃度生物學(xué)參數(shù)：菌體濃度，形態(tài)，雜菌物理參數(shù)：溫度，壓力，攪拌，粘度化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度，pH，溶解氧，尾氣，補(bǔ)料，消泡1422.7.1生物學(xué)檢測(cè)主要的參數(shù)與控制1.細(xì)胞形態(tài)鏡檢：顯微鏡檢測(cè)，染色，光學(xué)、熒光，電鏡應(yīng)用：是否污染，發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)，菌種的真實(shí)性。1432.菌體濃度概念：菌濃：?jiǎn)挝惑w積發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)菌體細(xì)胞的含量。應(yīng)用：決定適宜補(bǔ)料量、供氧量等，以得到最佳生產(chǎn)水平。144臨界菌體濃度控制概念：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時(shí)的菌體濃度

菌體濃度超過(guò)此濃度，抗生素的生產(chǎn)速率會(huì)迅速下降。菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質(zhì)特性的綜合反映。1453.發(fā)酵污染雜菌的檢測(cè)與控制種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底空氣帶菌設(shè)備及其附件滲漏1462.7.2物理參數(shù)的檢測(cè)與控制1.溫度的檢測(cè)與控制發(fā)酵溫度概念:發(fā)酵中的所維持溫度在生長(zhǎng)和生產(chǎn)的最適溫度范圍內(nèi)測(cè)定：熱電阻等熱敏原件測(cè)定，溫度計(jì)上讀出。147（1）發(fā)酵熱的構(gòu)成與計(jì)算發(fā)酵熱（fermentationheat）產(chǎn)生熱與散失熱之差產(chǎn)生熱：生物熱和攪拌熱散失熱：蒸發(fā)熱、顯熱和輻射熱。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪伴－Q蒸發(fā)－Q顯－Q輻射148生物熱(biologicalheat)概念：菌體生長(zhǎng)過(guò)程中直接釋放到體外的熱能。影響因素：培養(yǎng)基成分：越豐富，生物熱越多。菌體濃度、呼吸強(qiáng)度：越大，生物熱越多。不同生長(zhǎng)階段：生物熱也不同。發(fā)酵熱平衡的主要依據(jù)：對(duì)數(shù)期的生物熱149攪拌熱(agitationheat)概念：攪拌器引起的液體做機(jī)械運(yùn)動(dòng)時(shí)因?yàn)槟Σ了a(chǎn)生的熱量。影響因素：發(fā)酵罐：攪拌設(shè)備、攪拌方式培養(yǎng)基：發(fā)酵液黏度。計(jì)算：?jiǎn)挝惑w積發(fā)酵液的消耗功率與熱功量（3600kJ/kWh）的乘積。150散失熱蒸發(fā)熱：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐后，引起水分蒸所需的熱能。顯熱：廢氣排出時(shí)帶走的熱能。輻射熱：發(fā)酵液中部分熱能以輻射熱的形通過(guò)罐體輻射到大氣中。影響因素：溫度差異而造成的熱能損失。發(fā)酵溫度、通氣溫度和流量等151發(fā)酵熱計(jì)算發(fā)酵熱＝攪拌熱＋生物熱--冷卻熱（1）根據(jù)冷卻水流量、溫度變化。（2）根據(jù)罐溫與時(shí)間的變化（3）根據(jù)化合物的燃燒熱1M葡萄糖產(chǎn)生281J

152（2）溫度的選擇原則選擇最適溫度并嚴(yán)格控制。不同菌種：不同溫度。兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：生長(zhǎng)階段，選擇適宜的菌體生長(zhǎng)溫度，生產(chǎn)階段選擇最適宜的產(chǎn)物生產(chǎn)溫度。后期降溫控制：避免產(chǎn)物降解。153（3）溫度的控制方式一般不需要加熱，往往經(jīng)常需要降溫冷卻夾套層、蛇形管，熱交換；冷卻水降溫：滯后，需要一定的經(jīng)驗(yàn)和技巧冷凍鹽水循環(huán)式降溫：迅速建立冷凍站：提高冷卻能力發(fā)酵溫度與冷卻偶聯(lián)1542.壓力的檢測(cè)與控制概念：罐體內(nèi)的壓力，由壓力表讀出。罐壓的影響：維持正壓，防止污染;CO2和O2的溶解度不同生物對(duì)壓力耐受不同控制：進(jìn)或出口閥門(mén)，進(jìn)入或排出氣體或空氣流量維持工藝所需壓力：0.02－0.05MPa1553.攪拌的檢測(cè)與控制攪拌的影響：氣體的傳遞速度和發(fā)酵液的混合均勻程度攪拌指標(biāo)：攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌功率。攪拌控制策略：發(fā)酵中不同階段對(duì)氧需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。1562.7.3化學(xué)參數(shù)的檢測(cè)與控制基質(zhì)濃度pH溶解氧尾氣1571.基質(zhì)濃度的檢測(cè)與控制基質(zhì)濃度：發(fā)酵液中糖、氮、磷等發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度檢測(cè)：在線(xiàn)或離線(xiàn)。1582.pH檢測(cè)與控制發(fā)酵中pH的變化是酸和堿綜合表現(xiàn)。酸的來(lái)源：糖類(lèi)原料中的酸性雜質(zhì)；糖在高溫滅菌中氧化或反應(yīng)生成酸；糖被代謝生成有機(jī)酸，分泌到培養(yǎng)液。堿的來(lái)源：水解酪蛋白和酵母粉等作為碳源利用。159控制pH策略分階段控制：生長(zhǎng)最適pH和產(chǎn)物最適pH。緩沖液控制：碳酸鈣和磷酸鹽緩沖液。補(bǔ)加酸或堿進(jìn)行控制：補(bǔ)料方式控制：流加糖率來(lái)控制pH。1603.溶解氧的檢測(cè)與控制概念：溶于培養(yǎng)液中的氧含量表示：絕對(duì)含量，飽和氧濃度的百分?jǐn)?shù)。檢測(cè)：在線(xiàn)溶氧電極。控制策略：供應(yīng)量和需要量二個(gè)方面考慮使之需氧不超過(guò)設(shè)備的供氧能力。161供氧oxygensupply原理氧溶解過(guò)程：氧從空氣氣泡擴(kuò)散到培養(yǎng)液氧溶解速率：dissolvedoxygenrate氧傳遞速率：oxygentransferrate,OTR162耗氧oxygenconsumption菌體吸收溶解氧的過(guò)程攝氧速率(Oxygenuptakerate，OUR)耗氧速率163臨界氧濃度不影響呼吸或產(chǎn)物合成的最低溶解氧濃度。供氧必需大于或等于耗氧溶解氧速率大于或等于菌體攝氧速率，才能使發(fā)酵正常進(jìn)行。164臨界溶氧測(cè)定測(cè)定：尾氣O2變化和通氣量；溶氧電極細(xì)菌和酵母：3－10％放線(xiàn)菌：5－30％霉菌：10－15％。呼吸臨界氧濃度和合成臨界氧濃度可能不一致。165影響供氧因素－氧推動(dòng)力增加氧分壓：通入純富氧空氣，增加溶氧濃度，不經(jīng)濟(jì)。提高罐壓：增加CO2濃度，對(duì)設(shè)備要求高改變通氣速率：兩倍，有時(shí)達(dá)5－10倍。降低發(fā)酵溫度166影響供氧因素－體積傳遞系數(shù)KLa攪拌器設(shè)計(jì)，類(lèi)型、葉片、直徑、擋板、位置空氣分布器的類(lèi)型與位置增加攪拌強(qiáng)度增加擋板167其他工藝條件改變培養(yǎng)基粘度液化培養(yǎng)基中間補(bǔ)水添加表面活性劑等間接策略:控制菌體濃度1681694.廢氣檢測(cè)與控制廢氣中的氧含量和細(xì)胞的攝氧速率有關(guān)二氧化碳為細(xì)胞呼吸產(chǎn)生并釋放出應(yīng)用于計(jì)算：細(xì)胞的攝氧速率、呼吸速率和發(fā)酵罐的供氧能力。170攝氧率OURCO2釋放率CER1712.7.4泡沫foam的檢測(cè)與控制概念：氣體分散在少量液體中，氣體與液體之間被一層液膜隔開(kāi)就形成了泡沫。液面上的泡沫，氣相所占比例大，與液體有明顯界限。流態(tài)泡沫，分散于發(fā)酵液內(nèi)部，比較穩(wěn)定，與液體之間無(wú)明顯界限。1721、泡沫形成的原因及其影響發(fā)泡物質(zhì)：蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)，黃豆餅粉，代謝產(chǎn)物。快速攪拌、滅菌體積太大或不徹底。發(fā)泡影響：減少裝料量，降低氧傳遞。逃液，增加了污染，甚至無(wú)法攪拌。菌體呼吸受阻，代謝異?；蜃匀?732、泡沫控制培養(yǎng)基調(diào)整與工藝控制：少加或緩加起沫基質(zhì)；改變發(fā)酵條件，如pH、升高溫度、減少通氣、降低攪拌速率;改變發(fā)酵工藝，如分批投料。174機(jī)械消沫mechanicaldefoaming機(jī)械強(qiáng)烈震動(dòng)或壓力變化使泡沫破裂。罐內(nèi)消沫槳轉(zhuǎn)動(dòng)打破泡沫泡沫引出罐外，通過(guò)噴嘴加速力或離心力消除泡沫。消沫轉(zhuǎn)子上添加消沫劑，能增強(qiáng)消沫效果。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省原料，污染機(jī)會(huì)低，但效果不理想。175化學(xué)消沫用消沫劑(defoamingagent)消沫機(jī)理：加入消沫劑，降低了泡沫的液膜強(qiáng)度和表面黏度，使泡沫破裂。種類(lèi)：天然油脂類(lèi)：動(dòng)植物油脂高碳醇脂肪酸和酯類(lèi)：十八醇，聚乙二醇。聚醚類(lèi)：聚氧乙烯氧丙烯甘油，泡敵硅酮類(lèi)：不容于水，10％乳液。176消沫劑的使用取決于在發(fā)酵液中擴(kuò)散能力。與惰性載體、乳化劑或分散劑并用消沫劑之間聯(lián)合使用，也能互補(bǔ)增效。消沫劑的添加會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程，微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，要注意其不良影響。1772.7.5發(fā)酵終點(diǎn)的判斷最低成本獲得最大生產(chǎn)能力的時(shí)間。原料和發(fā)酵成本的影響因素：產(chǎn)率：?jiǎn)挝惑w積、單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量得率：轉(zhuǎn)化率，單位原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量發(fā)酵系數(shù)：?jiǎn)挝话l(fā)酵周期內(nèi)發(fā)酵體積生成產(chǎn)物體積產(chǎn)率：發(fā)酵單位除以總發(fā)酵時(shí)間1781、經(jīng)濟(jì)原則在最大生產(chǎn)率時(shí)，終止發(fā)酵。發(fā)酵總生產(chǎn)周期：最短1792、產(chǎn)品質(zhì)量原則對(duì)后續(xù)分離純化的影響：發(fā)酵時(shí)間太短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)殘留補(bǔ)料或消沫劑的殘留，以允許的殘量為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵時(shí)間太長(zhǎng)，菌體自溶，改變發(fā)酵液性質(zhì)增加分離純化難度。對(duì)于抗生素，放罐前16小時(shí)停止補(bǔ)料和消沫。180生物、物理、化學(xué)指標(biāo)產(chǎn)物濃度，過(guò)濾速度，菌體形態(tài)，氨基氮，pH，發(fā)酵液的外觀(guān)和粘度等。一般自溶前放罐。按照常規(guī)經(jīng)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行作業(yè)。特殊因素染菌、代謝異常等情況。1812.8抗生素生產(chǎn)工藝以青霉素為例1822.8青霉素的生產(chǎn)工藝青霉素的概述生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性發(fā)酵工藝過(guò)程提煉工藝過(guò)程183一概述－發(fā)現(xiàn)1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周?chē)霈F(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無(wú)法分離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測(cè)活性，青霉素結(jié)晶。184發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對(duì)4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時(shí)內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開(kāi)始治療第一批人類(lèi)病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個(gè)單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。185概述－作用機(jī)理細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長(zhǎng)中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無(wú)效高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物186概述－應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。187二青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。188發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)過(guò)程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類(lèi)脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機(jī)理貯藏物，沒(méi)有空泡，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無(wú)顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。189鏡檢規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀(guān)察7個(gè)時(shí)期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體適宜為種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過(guò)工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。190三發(fā)酵工藝過(guò)程1911生產(chǎn)孢子制備工作斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天，25℃。注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。192搖瓶實(shí)驗(yàn)其實(shí)是試管實(shí)驗(yàn)的放大，把試管里進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，放到三角瓶中進(jìn)行，為了促進(jìn)供氧，就把三角瓶放在搖床上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

從試管到三角瓶，再到卡氏罐，是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，主要是為了找出大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)是實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)之間的差距。1932種子罐培養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h1943生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；接種量20％。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時(shí):pH6.4-6.6，26℃；60小時(shí)后:pH6.7,24℃。1954發(fā)酵培養(yǎng)與過(guò)程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3。帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h。196（1）過(guò)程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長(zhǎng)合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。197流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過(guò)低使抗生素合成速度減慢或停止，過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開(kāi)始升高時(shí)流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。198流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。199鹽離子控制無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對(duì)青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹(shù)脂保護(hù)層。200（2）添加青霉素側(cè)鏈前體時(shí)期：合成階段。種類(lèi)：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%?？刂疲罕３止?yīng)速率略大于生物合成需要。201提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護(hù)劑；分散劑202（3）溫度控制適宜菌絲生長(zhǎng)溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。變溫控制，不同階段不同溫度。生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃。203（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過(guò)7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴(lài)pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）204（5）溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同。205（6）消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵（丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚）。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。206四提煉工藝過(guò)程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。2071預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液。濃度較低：10－30kg/m3。含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等。目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白。2082過(guò)濾鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0％）2093、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?－3次。210逆流萃取過(guò)程正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取2－3次，達(dá)到結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。2114脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過(guò)濾，除去活性炭。2125結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。2135結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過(guò)洗滌、干燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產(chǎn)品。2142.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝215一氨基酸類(lèi)藥物的基本概念α氨基酸216氨基酸及其衍生物在藥中的應(yīng)用氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其與疾病治療的關(guān)系必需氨基酸—人和哺乳動(dòng)物自身不能合成，需要由食物供應(yīng)，稱(chēng)為必需氨基酸。賴(lài)氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥(niǎo)天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，賴(lài)氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。217治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羥色氨酸、左旋多巴等。用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用218二氨基酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)方法1發(fā)酵法2水解法3酶法轉(zhuǎn)化219L－異亮氨酸的制備培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液過(guò)濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉淀水結(jié)晶干燥L(fēng)－異亮氨酸成品1發(fā)酵法220工藝過(guò)程1）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（％）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級(jí)種子培養(yǎng)基加菜籽油，其余同一級(jí)種子培養(yǎng)基。一級(jí)種子培養(yǎng)：1000ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種（鈍齒棒桿菌），搖床30℃16h。二級(jí)種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h。逐級(jí)放大。2）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（％）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，淀粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1％菌種（v/v），攪拌，發(fā)酵。2213）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min，冷卻過(guò)濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過(guò)濾除沉淀。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹(shù)脂量1.5％的流速進(jìn)H＋型732離子交換柱（φ40×100cm),以100L去離子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）精制，烘干2222水解法（一）基本原理蛋白質(zhì)水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉淀法、吸附法、離子交換法氨基酸精制方法結(jié)晶，重結(jié)晶223L－胱氨酸的制備：人發(fā)或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水水解法舉例224延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液L－Asp粗品分離L-Asp精品轉(zhuǎn)化液固定化L－Asp－β－脫羧酶濃縮結(jié)晶L－Ala粗品L－Ala精品精制3酶法轉(zhuǎn)化天冬氨酸和丙氨酸的制備225工藝過(guò)程1）菌種培養(yǎng)大腸桿菌（E.coli）AS1.881的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基成分（％）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調(diào)pH6.0，煮沸后過(guò)濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種子于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)24h，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至1000～2000ml規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol/LHCl調(diào)pH5.0，升溫至45℃并保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（％）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量40ml。搖瓶培養(yǎng)基組成（％）為L(zhǎng)－谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。將培養(yǎng)24h的新鮮斜