實(shí)驗(yàn)2重組質(zhì)粒的提取及鑒定2012邵

1實(shí)驗(yàn)二 重組DNA的提取及酶切鑒定復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心邵紅霞;.cn2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找韵路椒ê图夹g(shù)：1.質(zhì)粒DNA的小量快速制備2.質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切3.DNA的瓊脂糖凝膠電泳3二、實(shí)驗(yàn)原理

分離質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟：1.培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2.收集和裂解細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)：SDS裂解）

3.分離和純化質(zhì)粒DNA（本實(shí)驗(yàn)：堿變性法）1.質(zhì)粒DNA的小量快速制備4堿變性法抽提質(zhì)粒DNASolutionIIpH12.6SolutionIIIpH4.8離心后去向染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開不能復(fù)性沉淀中質(zhì)粒DNA氫鍵部分?jǐn)嗔眩琧ccDNA互補(bǔ)鏈不完全分離復(fù)性上清中52.質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切

EcoRI+ClaI雙酶切（酶切完全時(shí)）

瓊脂糖凝膠電泳凝膠中2條區(qū)帶

4.3kbpBR322質(zhì)粒載體片段

1.4kbc-myc目的基因片段1.4kbEcoRIClaI4.3kbc-myc-pBR3225.7kb6 瓊脂糖——海藻中提取的線狀高聚物 加熱融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝膠3.瓊脂糖凝膠電泳78DNA在凝膠中的遷移率的影響因素DNA分子的大小瓊脂糖的濃度

DNA的構(gòu)象

所加電壓嵌入染料的存在電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度910不同含量標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖凝膠濃度線狀DNA分子分離范圍（%，m/V）（kb）0.35~600.51~300.61~200.70.8~121.00.5~101.20.4~61.50.2~42.00.1~311

質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)象瓊脂糖凝膠電泳凝膠中1、2、3條帶都有可能共價(jià)閉合環(huán)形DNA開環(huán)DNA線性DNA12DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液13 1%瓊脂糖凝膠電泳中： 溴酚藍(lán)遷移速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同； 二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4000bp的DNA相同增加樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔里使樣品呈現(xiàn)顏色在電場(chǎng)中可預(yù)知速率（向陽(yáng)極涌動(dòng)的染料）14三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑（詳見實(shí)驗(yàn)講義）15四、實(shí)驗(yàn)步驟

（詳見實(shí)驗(yàn)講義）1.質(zhì)粒DNA的小量快速制備（AXYGENAxyPrep質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒）注意事項(xiàng)：1.首次使用前，將RNaseA全部加入BufferS1中，4℃貯存2.首次使用前，BufferW2concentrate中加入指定體積的無(wú)水乙醇3.使用前檢查BufferS2是否出現(xiàn)沉淀，若有應(yīng)在37℃加熱溶解并冷卻至室溫使用4.自行準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的tip頭和離心管5.BufferS2使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率16用加樣槍將細(xì)菌培養(yǎng)物加入1.5ml離心管，12000rpm，1min加250μlBufferS1，吹打混勻（也可Vortex）以充分懸浮細(xì)菌加250μlBufferS2，上下顛倒，溫和混勻4~6次使菌體裂解加350μlBufferS3，上下顛倒，溫和混勻6~8次，12000g離心10min吸取上清至已置于2ml離心管的制備管中，12000g離心1min，棄濾液同上，在制備管中加500μlBufferW1，12000g離心1min，棄濾液在制備管中加700μlBufferW2，12000g離心1min，棄濾液，重復(fù)以BufferW2洗滌（離心）一次，再空離心1次將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加60μlEluent或去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min，即為質(zhì)粒DNA。避免劇烈搖晃，此步驟不宜超過(guò)5min避免劇烈搖晃重復(fù)2次Eluent液65度溫育可提高洗脫效率請(qǐng)保持同步！離心機(jī)配平172.質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶的雙酶切Buffer42μlEcoRⅠ(16U/μl)1μlClaⅠ(10U/μl)1μlddH2O6μl質(zhì)粒DNA10μl20μl混勻后短暫離心，37℃水浴1小時(shí)注意：加樣順序保證每樣試劑加入反應(yīng)體系乙?；疊SA可不加加樣完成后需混勻，短暫離心反應(yīng)結(jié)束后需短暫離心后加凝膠加樣緩沖液及時(shí)將酶放回-20℃冰箱以保證酶的活力18準(zhǔn)備好制膠器，插好梳子并保證梳子距底部0.5mm-1.2mm灌膠（事先加EB,帶手套，并及時(shí)更換手套）注意趕氣泡待凝準(zhǔn)備好凝膠，加熱熔解19注意事項(xiàng)：標(biāo)液面高度以觀察水分是否蒸發(fā)過(guò)多，若溶解后水分蒸發(fā)過(guò)多，補(bǔ)水2.三角燒瓶上覆打過(guò)洞的保鮮膜（防水蒸發(fā)）防爆沸和燙傷（帶手套）待冷卻至55℃左右加3μlEBr后立即灌膠（戴手套）稱量agarose加入TAE60ml，勿晃微波爐溶膠注意先做好制膠準(zhǔn)備！20在電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液將制好的凝膠連同內(nèi)架放入電泳槽內(nèi)，保證液面高于凝膠面（在液體中拔去梳子）加入6×凝膠加樣緩沖液和DNA（1:5比例混合）依次加樣，并加好Marker連通電源，80V電泳至溴酚藍(lán)帶達(dá)到凝膠的1/2處結(jié)果觀察和記錄DNA從陰極向陽(yáng)極遷移EBr從陽(yáng)極向陰極遷移（加樣后不能移動(dòng)電泳槽?。?1凝膠成像及分析系統(tǒng)223.DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳制膠：1%agarose（含2μlEB)，防過(guò)熱暴沸上樣準(zhǔn)備（1份凝膠加樣緩沖液加5份DNA）上樣和電泳:每組上樣2個(gè)（未酶解質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物）未酶解質(zhì)粒10μl+2μl凝膠加樣緩沖液雙酶切產(chǎn)物20μl+4μl凝膠加樣緩沖液Marker5μl,放中間，2組1塊膠

各組先做好準(zhǔn)備，兩組統(tǒng)一集中上樣后電泳

電泳槽和電泳儀不可移動(dòng)2312M34

M:λDNA/HindIIIMarkers2,3c-myc-pBR322重組質(zhì)粒經(jīng)ClaI/EcoRI雙酶切1,4c-myc-pBR322重組質(zhì)粒（其中1應(yīng)該加含RNase的ddH2O，卻加成了普通的ddH2O）4.3kb1.4kb231309