實驗二SDSPAGE凝膠電泳(00001)課件

SDS凝膠電泳實驗二SDS凝膠電泳實驗原理實驗步驟注意事項SDS的優(yōu)點SDS的缺點實驗常見問題及處理小技巧實驗原理源起基本原理分類分離范圍丙烯酰胺N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺(TEMED)過硫酸胺(AP)激活作用激活作用共聚合基本原理之一陰離子去污劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。強還原劑巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。基本原理之二結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短軸長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電場作用下，其遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根據(jù)這一特點，就可以將各蛋白組分按分子量大小分開。電泳槽不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。濃縮膠濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。分離膠孔徑較小,通過選擇合適的凝膠濃度,可以使樣品很好的分離.濃縮效應(yīng)之二

電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。在快離子和慢離子之間形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面。由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成一條狹窄帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。

樣品進入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。此時蛋白質(zhì)在均一的外加電場下泳動，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動速率不同而形成一條條區(qū)帶。電荷效應(yīng)之一電荷效應(yīng)之二

與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得SDS電泳的泳動率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。因此，各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。分離范圍凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為1：29。上樣緩沖液之一

上樣緩沖液(SDS

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buffer)是一種以溴酚藍為染料，5倍濃縮的SDS凝膠電泳上樣緩沖液，用于常規(guī)的SDS蛋白電泳樣品上樣。

本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和使用時請務(wù)必注明，仔細區(qū)分。

上樣緩沖液

之三使用說明

1.按每4μl蛋白樣品加入1μl蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。

2.

100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。

3.

冷卻到室溫后取上清直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。

4.

通常電泳時染料到達膠的底端附近（0.5～1cm)即可停止電泳。

增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散出來到電泳緩沖液中。

指示劑檢測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿。上樣緩沖液

之四單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15min至24h，冰箱、室溫均可。甲醇/冰醋酸固定液染色劑考馬斯亮藍染色常用染色方法銀染法金屬離子染色法以考馬斯亮藍染色為例

考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍（4）1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8):

稱取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100ml（5）0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)：稱取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml（６）TEMED（四甲基乙二胺）（７）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml（８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻（９）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用（1０）脫色液：

冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml（1１）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml（12）高分子量標(biāo)準蛋白試劑盒:兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

置-20℃保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。（13）樣品：兔血清２.聚膠前準備

(1)配制10％過硫酸銨溶液(需每天新鮮配制)。(2)將單體儲存液、緩沖液、水按照一定比例配制成凝膠溶液。(3)將灌膠裝置準備好。(4)待凝膠溶液平衡至室溫(23~25℃)后，真空脫氣15min。1）.安裝膜具①將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,將凡士林均勻的涂在兩側(cè)的封條上，用封條將玻璃板封好。

②稱取2g瓊脂糖加100ml蒸餾水，慢慢的煮開（煮的過程中要不斷攪拌），將煮好的(無氣泡)瓊脂糖倒入支膠架三分之二高度，快速將兩側(cè)封好的玻璃板插入瓊脂糖中，注意凹槽朝外，用夾子固定好，待凝固后灌膠。2）制備SDS聚丙烯酰胺凝膠

①制備分離膠30%丙烯酰胺5ml+分離膠緩沖液5ml+10%SDS0.2ml+10%過硫酸銨0.2ml+蒸餾水9.6ml；混勻后加入8ulTEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入安裝好的垂直板中，灌膠時要勻速貼壁流入，防止氣泡產(chǎn)生。灌至離槽沿3cm處，立即在膠面上用移液管加入1-2cm的蒸餾水，靜置，待凝膠聚合后（約30min），去除水相，然后用吸水紙吸干殘余的水。②制備濃縮膠30%丙烯酰胺1.32ml+濃縮膠緩沖液1ml+10%SDS0.08ml+10%AP0.08ml+蒸餾水5.6ml；混勻后加入8ulTEMED,立即混勻（不能有氣泡），灌入垂直板至離槽沿0.5cm處，插入梳子（不能混入氣泡），靜置，待凝膠聚合后，加入電泳緩沖液，拔去梳子。③先用刀片將瓊脂糖剝離開，再將玻璃板從架子上取出，再用夾子固定在電泳槽內(nèi)（注意凹槽朝內(nèi)），將電泳緩沖液倒入電泳槽內(nèi)。

3).樣品預(yù)處理

取0.5ml樣品加入0.5ml上樣緩沖液，置沸水中煮5分鐘。

4).上樣

①第一個孔內(nèi)加20ul標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液

②其他每孔加入20ul樣品。上樣時要將移液槍頭垂直插入孔內(nèi)且要緩慢勻速推入樣品。

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向5).電泳

接通電源，將電壓調(diào)至80V、50mA。當(dāng)溴酚蘭進入分離膠后，把電壓提高到150V、80mA，電泳至溴酚蘭距離膠底部1-2cm處，停止電泳。

6).固定

取下凝膠，置于培養(yǎng)皿中的固定液中，輕輕振搖10分鐘，倒去固定液。

7).染色脫色

培養(yǎng)皿中倒入50-60度預(yù)熱的染色液浸沒凝膠，約40分鐘后回收染色液，用清水沖洗掉膠上多余的染色液。倒入脫色液，脫色2小時，期間換脫色液2-3次。電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后的凝膠照片圖1標(biāo)準蛋白質(zhì)與待測樣品電泳圖譜

940006200043000310002010014400注：膠槽1標(biāo)準蛋白；膠槽2、3樣品蛋白７.結(jié)果處理

標(biāo)準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準曲線求未知多肽鏈分子量。相對遷移率實驗注意事項

1.形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。2.注意不能隨便傾倒單體溶液，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。3.

TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。4.

過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。5.激活劑的用量:

激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。

6.溫度的影響聚膠的最佳溫度為23~25℃，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4℃冰箱)及玻璃板或管(有時從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時快。

7.氧氣的影響氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度脫氣至少15min。

8.凝膠添加劑：凝膠中常常加入SDS、尿素、TritonX-100等添加劑。SDS加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。

9.

聚膠時間：雖然應(yīng)用過硫酸銨／TEMED催化后灌膠15~20min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90min才能保證95％以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時聚膠時間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時間(完全聚合需8h)。

10.單體的濃度：是指單體總重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(w／v)，可選擇的范圍為3％~30％，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。

11.

SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。

12.

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準曲線。不能利用這次的標(biāo)準曲線作為下次用。并且SDS測定分子量有10％誤差，不可完全信任。13.

有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。

14.

有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

15.

如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。常見問題及處理辦法

１．紋理和拖尾現(xiàn)象

由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。２．蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。

３．電泳時間比正常要長

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯誤。４．指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。

５.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全．

６.凝膠時間不對．

通常膠在30min內(nèi)凝聚．如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS劑不夠或者失效．7.出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。8.出現(xiàn)“鬼帶”如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

9.為什么溴酚藍不能起到指示作用？

我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。SDS的優(yōu)點設(shè)備簡單快速分辨率和靈敏度高特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定SDS的缺點1.有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，S