快速有效篩選目標微生物的新方法

宏基因組學

第一節(jié)什么是宏基因組學第二節(jié)宏基因組學技術流程第三節(jié)宏基因組學的應用當前1頁，總共25頁。第一節(jié)什么是宏基因組學背景知識：

迄今，人們對微生物世界的認識基本都來源于對占細菌總種數不到1％的微生物的單個種群的孤立研究結果。然而微生物是通過其群落而非單一種群來執(zhí)行在自然界物質與能量循環(huán)中的作用的，對微生物群落作為整體的功能認識遠遠落后于對其個體的認識。這種狀況不利于全面認識微生物在自然界所扮演的重要角色。為了獲得完整的環(huán)境微生物基因表達產物，早在1978年許多學者就提出了直接從環(huán)境中提取微生物DNA的思路，1998年，ARIADpharmaceutical公司的科學家Handelsman等首次提出宏基因組的概念。

當前2頁，總共25頁。宏基因組(thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature)是指生境中全部微生物基因的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物的基因總和，微生物主要包括環(huán)境樣品中的細菌和真菌。宏基因組學(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學、元基因組學或生態(tài)基因組學。它主要研究從環(huán)境樣品獲得的基因組中所包含的微生物的遺傳組成及其群落功能，為充分認識和開發(fā)利用非培養(yǎng)微生物，并從完整的群落水平上認識微生物的活動、最大限度地挖掘微生物資源提供了可能

當前3頁，總共25頁。第二節(jié)宏基因組學技術流程從環(huán)境中提取宏基因組DNA；用核酸內切酶切割成一定長度的DNA片段并連接到合適的載體上；轉化宿主菌，形成一個重組的DNA文庫即宏基因組文庫；宏基因組文庫篩選。當前4頁，總共25頁。一、環(huán)境樣品DNA提取

提取步驟通常需要滿足兩個條件：①盡可能提取樣品所有微生物的基因，②保持片段的完整和純度。目前所開發(fā)的DNA提取方法有兩種：

細胞提取法和直接裂解法當前5頁，總共25頁。直接裂解法：

物理法：凍融法、超聲法、玻璃球珠擊打法、液氮碾磨法

化學法：常用化學試劑有表面活性劑、鹽類、有機溶劑等

酶裂解法

依據提取樣品總DNA前是否分離細胞，可以分為原位裂解法和異位裂解法。當前6頁，總共25頁。1、原位裂解法（直接提取法）原位裂解法是在環(huán)境樣品中加入DNA提取緩沖液，使細胞裂解然后從樣品中直接提取DNA并純化的方法。

優(yōu)缺點：該法提取的DNA產量較高，操作容易、成本低，但純度低，腐植酸等污染嚴重，往往還需要經過純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學操作的需要，此外，由于機械剪切作用較強，提得的DNA片段長度有限（1-50Kb），常適用于構建小片段插人文庫(以質粒和噬菌體為載體)的DNA提取。

當前7頁，總共25頁。2、異位裂解法異位裂解法是先把微生物細胞從環(huán)境樣品中分離出來，再從微生物細胞提取DNA并純化。優(yōu)缺點：所得的DNA純度較高，但DNA產量及所包含的基因組信息的廣泛性不及直接提取法并且操作繁瑣、成本高、得率低。間接提取法提得的DNA片段長度相對較長（20-500Kb），適合構建黏粒（cosmid）文庫和細菌人工染色體（BAC）文庫。當前8頁，總共25頁。

二、宏基因組文庫構建當前9頁，總共25頁。1、載體系統(tǒng)選擇常用的克隆載體有:質粒載體(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10kb；Cosmid(黏粒載體，如pWE15)，插入片段30～45kb；BAC(細菌人工染色體，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。當前10頁，總共25頁。選擇合適的載體系統(tǒng)，應考慮以下因素:

所提DNA的質量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數、使用的宿主以及篩選方法等。如對腐殖質含量較高或剪切較嚴重的DNA樣品適宜構建質粒文庫，小片段的文庫適用于篩選新的與代謝相關的單基因或小操縱子。而對于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則適宜構建Cosmid、Fosmid或BAC文庫，從而篩選由較大基因簇編碼的復雜代謝途徑或能夠表征環(huán)境中未培養(yǎng)微生物基因組的較大基因片段。

當前11頁，總共25頁。

2、宿主系統(tǒng)選擇

宿主菌株的選擇主要考慮：轉化效率，重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性，宿主能否為相關功能基因提供必需的轉錄表達體系，對異源表達基因產物提供必需的轉錄表達體系，對異源表達基因產物是否有較強的相容性，以及目標性狀(如抗菌性)及缺陷型等因素。

研究表明，不同微生物種類所產生的活性物質有明顯差異，不同的研究目標應選擇不同的宿主菌株。鑒于7O%的抗生素來源于放線菌的事實，若以尋找抗菌、抗腫瘤活性物質為目標，選擇鏈霉菌為宿主較理想；而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。當前12頁，總共25頁。3、轉化

在宏基因組克隆中，所謂轉化是指通過適當的方法使宿主細胞處于感受態(tài)，從而攝取重組DNA的水平方向的基因轉移過程。其方法有CaC12法和電穿孔法。CaC12法即用高濃度的Ca2+誘導細胞使其成為能攝取外源DNA的感受狀態(tài)，該方法自建立以來已廣泛用于以大腸桿菌為受體的重組質粒的轉化，但該方法轉化效率不高。電穿孔法是用高壓脈沖電流擊破宿主細胞膜或擊成小孔，從而使外源DNA由小孔進入細胞，該方法轉化效率較高。當前13頁，總共25頁。三、宏基因組文庫篩選1功能驅動的篩選2化合物結構水平的篩選3序列驅動的篩選4底物誘導的篩選當前14頁，總共25頁。1功能驅動的篩選

功能驅動的篩選(Function-drivenscreening)即基于活性的篩選。是根據重組克隆產生的新活性而進行篩選的方法。優(yōu)點：只要基因能在宿主中表達，就可以根據基因表達特性進行篩選，能迅速找到可用于工農業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的酶等蛋白質和抗生素等天然產物；缺點：目的基因必須能在宿主中進行功能表達，而基因表達與否除了和宿主有關外，還決定于基因本身的完整性，這就要求一方面要選擇合適的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全長，一旦克隆過程中基因的某個組件遭到破壞將使基因無法表達，也就不能根據表型加以篩選。篩選工作量大、效率低。當前15頁，總共25頁。2化合物結構水平的篩選化合物結構水平的篩選(Screeningoncompoundstructure)是根據不同結構的物質在色譜中有不同的吸收峰值，通過比較轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，篩選產生新結構化合物的克隆子。這一方法可直接篩選到新結構化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。當前16頁，總共25頁。3序列驅動的篩選序列驅動的篩選(Sequence-drivenscreening)是根據已知功能的基因序列設計探針或PCR引物，通過核酸雜交或PCR擴增來篩選具有目標序列的克隆子。優(yōu)點：不依賴克隆基因在宿主菌株中的表達。缺點：必須對相關基因序列有所了解，無法篩選宏基因組文庫中那些和現有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。當前17頁，總共25頁。PS：通過DNA微陣列技術(基因芯片技術)尋找環(huán)境基因組序列中的有用片段也是一種全新的篩選技術，它可以快速有效的識別和描述許多菌落的特征，并可應用于大量保守基因的分離?；谛蛄械暮Y選策略可以利用基因芯片技術大大提高篩選效率，有可能篩選到某一類結構或功能的蛋白質中的新分子，但必須對相關基因序列有一定的了解，較難發(fā)現全新的活性物質。當前18頁，總共25頁。4底物誘導的篩選底物誘導的篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合適的底物進行誘導，使克隆子分解代謝基因表達來進行篩選的方法。優(yōu)點：為高通量篩選提供了保障，而且不需要對底物進行修飾；可以從底物推斷出未知的酶，進而推斷基因的功能;缺點：對目標基因的結構性和適應性很敏感，用于誘導的底物必須要進入細胞質，若不能進入細胞質，則無法誘導目的基因的表達；但是某些基因的表達不僅受底物誘導，還可受其他因子的誘導；某些基因無需誘導即能表達；某些本可誘導表達的基因由于宿主的改變而無法誘導表達。而且FACS（熒光激活細胞分揀術）對進樣設備的要求也比較高。當前19頁，總共25頁。第三節(jié)宏基因組學的應用當前20頁，總共25頁。1、在生態(tài)學方面的應用

宏基因組在生態(tài)學上的應用主要是土壤與水體。目前其在土壤微生物研究中的應用主要包括兩方面：一、進行土壤微生物及其資源的挖掘。目前的研究工作已經得到大批新基因，特別是在一些極端環(huán)境中的微生物宏基因組的研究中得到了一些具有特殊應用價值的功能酶基因二、揭示土壤微生物的多樣性及其與環(huán)境之間的關系。

在水體中的應用：海洋蘊涵著非常豐富的微生物資源，目前已應用宏基因組技術研究了多種海洋次生代謝產物合成途徑，其中最為經典的是研究海洋聚酮類和非核糖體肽類的生物合成基因簇。當前21頁，總共25頁。

2、在新型生物催化劑中的應用

新型催化劑主要是酶。傳統(tǒng)的新型酶的篩選方法限制了篩選的廣泛性和有效性。宏基因組學則克服了這一限制，有效地提高了新酶的篩選效率?，F已發(fā)現了抗生素及維生素生物合成相關基因簇的克隆，以及水解酶類和氧化還原酶類編碼的基因。宏基因組技術通過對環(huán)境的直接克隆，為研究和利用占微生物99％以上的非培養(yǎng)微生物提供了新的途徑，為微生物的研究和發(fā)展提供了全新的策略。

當前22頁，總共25頁。3、人類宏基因組測序

人類宏基因組即人體所有共生微生物遺傳物質的總和。利用能夠容納大插人片段的克隆載體，盡可能地將人體全部共生微生物的基因組進行克隆，從而構建出人類宏基因組文庫。據估計，人類宏基因組計劃可能發(fā)現的新基因將超過100萬個，這對于許多疾病發(fā)生機理的闡明、新藥的研發(fā)、藥物毒性的控制等都將產生重大影響。當前23頁，總共25頁。小結宏基因組學為人類開發(fā)利用