流式細胞儀的原理介紹

流式細胞儀的原理及應用馬黎明生命科學與技術學院當前1頁，總共71頁。流式細胞術的基本概念流式細胞術(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性（如大小、內(nèi)部結構、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術。當前2頁，總共71頁。流式細胞術的特點流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量當前3頁，總共71頁。流式細胞儀的基本概念

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。當前4頁，總共71頁。BDFACSCanto流式細胞分析儀

當前5頁，總共71頁。流式細胞儀的檢測范圍細胞結構細胞大小細胞顆粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細胞功能?細胞表面/胞漿/核的特異性抗原?細胞活性?細胞內(nèi)/外的細胞因子?激素結合位點?細胞受體?鈣離子濃度?線粒體膜電位?

……當前6頁，總共71頁。一、流式細胞儀的工作原理采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。當前7頁，總共71頁。1.流式細胞儀的基本結構（1）液流系統(tǒng)（2）光學系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)當前8頁，總共71頁。（1）液流系統(tǒng)由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

當前9頁，總共71頁。液流系統(tǒng)示意圖當前10頁，總共71頁。液流速度：低速、中速、高速低速：10ul/min;中速：60ul/min;高速：120ul/min.當前11頁，總共71頁。（2）光學系統(tǒng)由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透鏡組、濾片和光電倍增管組成。FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector當前12頁，總共71頁。（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

主要由計算機和及其軟件（BDFASCDiva和BDModFitLTTM）組成。當前13頁，總共71頁。流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別區(qū)別流式細胞儀光學顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統(tǒng)計計算機人工結果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)當前14頁，總共71頁。二、散射光的測量細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。當前15頁，總共71頁。前向散射光（FS）

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。

通常在FCM應用中，選取FS作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。當前16頁，總共71頁。前向散射光示意圖FALSSensorLaser當前17頁，總共71頁。側向散射光（SS）

側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結構屬性。當前18頁，總共71頁。側向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser當前19頁，總共71頁。

光散射測量的用途

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

當前20頁，總共71頁。三、熒光的測量熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。當前21頁，總共71頁。熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)當前22頁，總共71頁。熒光信號的檢測使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量當前23頁，總共71頁。四、細胞分選原理

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。當前24頁，總共71頁。細胞分選示意圖細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電當前25頁，總共71頁。五、數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設門分析技術當前26頁，總共71頁。（一）參數(shù)說明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少當前27頁，總共71頁。（二）數(shù)據(jù)顯示方式直分析方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖二維等高圖假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析當前28頁，總共71頁。1.單參數(shù)直方圖

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。當前29頁，總共71頁。單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel)當前30頁，總共71頁。2.雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。當前31頁，總共71頁。雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度當前32頁，總共71頁。（三）設門分析技術1.Gate設置：指根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。當前33頁，總共71頁。A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門當前34頁，總共71頁。線性門當前35頁，總共71頁。

2.

區(qū)閾（Region設置）:

如十字門分析時，由四個區(qū)閾構成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+當前36頁，總共71頁。六、流式細胞儀免疫分析的技術要求

樣本制備標記染色質(zhì)量控制當前37頁，總共71頁。（一）免疫樣品的制備培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細胞懸液當前38頁，總共71頁。單細胞懸液的制備與保存新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）當前39頁，總共71頁。（二）常見的熒光染料名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高當前40頁，總共71頁。（三）免疫熒光標記熒光染料與細胞成分的四種結合方式

結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法

直標:干擾少,但需購買多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體

當前41頁，總共71頁。（三）流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制1.單細胞懸液制備的質(zhì)控適當?shù)闹苽浞绞綄嶓w組織來源標本用機械法溫度25-37℃，pH7.0-7.2當前42頁，總共71頁。2.免疫熒光染色的質(zhì)控溫度pH染料濃度固定劑當前43頁，總共71頁。3.儀器操作的質(zhì)控光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準:保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準:保證計數(shù)的準確性。當前44頁，總共71頁。4.免疫檢測的質(zhì)控同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調(diào)整和設置電壓，以保證特異性。（通常采用未染色細胞作為陰性對照）全程質(zhì)量控制：同型對照與待測標本一起標記和檢測，該實驗結果可靠。當前45頁，總共71頁。七、流式細胞儀的科研應用樹突細胞研究干細胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細胞動力學功能研究環(huán)境微生物分析流式細胞術與分子生物學研究流式細胞術在免疫檢驗中的應用當前46頁，總共71頁。FCM在細胞生物學中的應用當前47頁，總共71頁。DNA細胞周期分析ScelldivisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)當前48頁，總共71頁。

細胞周期（cellcycle）G1期(DNA合成前期)從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，此期主要合成RNA和核糖體。

S期(DNA合成期)除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。

G2期(DNA合成后期)大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括微管蛋白和促成熟因子等。M期（細胞分裂期）由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。G0期（細胞休眠期）暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執(zhí)行一定生物學功能的細胞所處的時期。

當前49頁，總共71頁。當前50頁，總共71頁。PI染色檢測細胞周期Protocol

離心收集細胞，棄上清，用PBS洗細胞兩次。加入預冷的70%乙醇，于40C固定過夜，或-200C長期固定。細胞染色：離心收集細胞，用1mlPBS洗細胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙錠（PI），100ug/mlRNaseA,0.2%TritonX-100)40C避光孵育30分鐘。流式細胞儀檢測：一般細胞計數(shù)2-3萬個。結果用軟件Modfit分析。當前51頁，總共71頁。

ModfitLT分析細胞周期當前52頁，總共71頁。當前53頁，總共71頁。

細胞周期結果分析CV值：又稱為變異系數(shù)，一般CV值越小，峰型越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結果，一般小于10%就可以認可了。G2/G1為1.82.（即G2期是四倍體細胞，而G1期是二倍體細胞，比值應為1.8-2.0之間。若小于1.8，則細胞染色不充分。當前54頁，總共71頁。Pengzhang;FreeRadicalResearch,2009,43(3):224-233.當前55頁，總共71頁。細胞凋亡的檢測細胞形態(tài)及細胞膜通透性的變化(Hoechest33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)

線粒體跨膜電位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰絲氨酸外化(AnnexinV-FITC/PI)Ca2+濃度升高(Fluo-3）DNA斷裂及含量的變化(TUNEL和PI）當前56頁，總共71頁。

FCM檢測細胞凋亡的特點

FCM能鑒別及定量分析凋亡細胞，揭示凋亡相關的分子及其功能機制，測定凋亡細胞功能特征的變化，并能對細胞的多個特征同時進行多參數(shù)測量，還具有簡便、快速、檢測所需細胞量少等優(yōu)點.當前57頁，總共71頁。

Annexin-V和PI雙染protocol

細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當?shù)娜旧彌_液（bindingbuffer）中以1x106細胞/mL的濃度重懸吸取100ul的細胞(1x105)至試管中。加進適量的熒光標記的annexin-V試劑和PI?；靹蚝蟊芄馐覝叵路跤?5分鐘。（必須在室溫下進行）孵育后加進400ul染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析。當前58頁，總共71頁。

Annexin-V和PI雙染的特點和注意事項檢測特點：簡便，快速，準確區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞。注意事項：1.細胞制備（如貼壁細胞）和儲存時細胞膜的破損會導致磷脂酰絲氨酸(PS)跨膜分布的改變，造成假陽性。2.染色后立即上機檢測。當前59頁，總共71頁。EffectofPQQonMeHg-induceddistributivechangeofearlyandlateapoptoticcells.(A)control.(B)PC12cellsweretreatedwithMeHgfor4h.(C)Cellswerepre-treatedwithPQQfor30minandthenwereexposedtoMeHgfor4h當前60頁，總共71頁。Q3:正常細胞；Q4：早期凋亡細胞；Q2：晚期凋亡細胞；Q1：壞死細胞。當前61頁，總共71頁。熒光補償當前62頁，總共71頁。當前6