實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理當(dāng)前1頁(yè)，總共49頁(yè)。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識(shí)：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．當(dāng)前2頁(yè)，總共49頁(yè)。(二)細(xì)菌的常識(shí)1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中的應(yīng)用當(dāng)前3頁(yè)，總共49頁(yè)。大腸桿菌當(dāng)前4頁(yè)，總共49頁(yè)。細(xì)菌的外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌當(dāng)前5頁(yè)，總共49頁(yè)。根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同將細(xì)菌分為兩大營(yíng)養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類型光能自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌當(dāng)前6頁(yè)，總共49頁(yè)。細(xì)菌的革蘭氏染色革蘭氏染色法是一種用于細(xì)菌的染色法。此法將細(xì)菌分為兩類，即革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽(yáng)性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌當(dāng)前7頁(yè)，總共49頁(yè)?！?/p>

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型(三)細(xì)菌的培養(yǎng)成分區(qū)別：瓊脂當(dāng)前8頁(yè)，總共49頁(yè)。2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、氧氣、滲透壓的要求．細(xì)菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物

0.25g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g瓊脂

1g水:50ml當(dāng)前9頁(yè)，總共49頁(yè)。4.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：擴(kuò)增細(xì)菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、保藏菌種當(dāng)前10頁(yè)，總共49頁(yè)。單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)?！罹?/p>

當(dāng)前11頁(yè)，總共49頁(yè)。液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)當(dāng)前12頁(yè)，總共49頁(yè)。☆無(wú)菌技術(shù)1.無(wú)菌技術(shù)的概念

無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。當(dāng)前13頁(yè)，總共49頁(yè)。（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：3.常用的消毒與滅菌的方法是指殺滅大部分病原微生物的方法。是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法當(dāng)前14頁(yè)，總共49頁(yè)。消毒的方法：1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒……當(dāng)前15頁(yè)，總共49頁(yè)。滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.當(dāng)前16頁(yè)，總共49頁(yè)。1、灼燒滅菌滅菌的方法：當(dāng)前17頁(yè)，總共49頁(yè)。2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.當(dāng)前18頁(yè)，總共49頁(yè)。1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考當(dāng)前19頁(yè)，總共49頁(yè)。實(shí)驗(yàn)用具LB固體培養(yǎng)基大腸桿菌菌液（LB液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)皿接種環(huán)酒精棉酒精燈鑷子、火柴、記號(hào)筆當(dāng)前20頁(yè)，總共49頁(yè)。當(dāng)前21頁(yè)，總共49頁(yè)。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程當(dāng)前22頁(yè)，總共49頁(yè)。二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作（一）培養(yǎng)基的配置與滅菌取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入當(dāng)前23頁(yè)，總共49頁(yè)。（二）倒平板滅菌后的培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面當(dāng)前24頁(yè)，總共49頁(yè)。注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板2.滅菌及消毒：無(wú)菌操作臺(tái)用超凈紫外燈和過(guò)濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時(shí)右手無(wú)名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.當(dāng)前25頁(yè)，總共49頁(yè)。（三）大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)。注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.當(dāng)前26頁(yè)，總共49頁(yè)。菌種擴(kuò)增搖床震蕩培養(yǎng)12h（于LB液體培養(yǎng)基中）本圖來(lái)自十一學(xué)校當(dāng)前27頁(yè)，總共49頁(yè)。（四）大腸桿菌的劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法當(dāng)前28頁(yè)，總共49頁(yè)。1、劃線分離法無(wú)菌操作臺(tái)上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.當(dāng)前29頁(yè)，總共49頁(yè)。平板劃線的操作當(dāng)前30頁(yè)，總共49頁(yè)。不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。當(dāng)前31頁(yè)，總共49頁(yè)。一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。當(dāng)前32頁(yè)，總共49頁(yè)。當(dāng)前33頁(yè)，總共49頁(yè)。當(dāng)前34頁(yè)，總共49頁(yè)。（四）大腸桿菌的劃線分離注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h1、劃線分離法當(dāng)前35頁(yè)，總共49頁(yè)。當(dāng)前36頁(yè)，總共49頁(yè)。問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。當(dāng)前37頁(yè)，總共49頁(yè)。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。當(dāng)前38頁(yè)，總共49頁(yè)。分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一當(dāng)前39頁(yè)，總共49頁(yè)。2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.當(dāng)前40頁(yè)，總共49頁(yè)。當(dāng)前41頁(yè)，總共49頁(yè)。劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更好呢？劃線分離：方法簡(jiǎn)單，但單菌落較難分開。涂布分離：?jiǎn)尉涓追珠_，但操作復(fù)雜。當(dāng)前42頁(yè)，總共49頁(yè)。（五）大腸桿菌分離后保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法當(dāng)前43頁(yè)，總共49頁(yè)。1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長(zhǎng)條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度當(dāng)前44頁(yè)，總共49頁(yè)。2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤(rùn)，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。當(dāng)前45頁(yè)，總共49頁(yè)。3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。當(dāng)前46頁(yè)，總共49頁(yè)。4.實(shí)驗(yàn)完成后,接種過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過(guò)菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄當(dāng)前47頁(yè)，總共49頁(yè)。5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸