時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)

標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程免疫熒光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金標(biāo)免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa，1977)時(shí)間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美國Luminex公司,1997)當(dāng)前1頁，總共22頁。①免疫熒光②放射免疫④化學(xué)發(fā)光⑥電化學(xué)發(fā)光

⑤時(shí)間分辨熒光③酶聯(lián)免疫當(dāng)前2頁，總共22頁。標(biāo)記免疫技術(shù)的理論檢測靈敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶聯(lián)免疫 10-9-10-10mol化學(xué)發(fā)光 10-15mol時(shí)間分辨熒光10-18mol電化學(xué)發(fā)光 10-18mol當(dāng)前3頁，總共22頁。一、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介紹基本原理技術(shù)特點(diǎn)反應(yīng)模式當(dāng)前4頁，總共22頁。背景介紹1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土離子標(biāo)記物的“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論1983年，Soini和Kojola首先開發(fā)出以鑭系元素為示蹤物的時(shí)間分辨熒光測量儀，建立了新的非放射性微量分析檢測技術(shù)。同一年，Pettersson等人運(yùn)用此儀器首次對(duì)人絨膜促性腺激素

(hCG)進(jìn)行了時(shí)間分辨熒光免疫分析1984年，Hemmila確定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)這種時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)方案,從而使DELFIA成為Wallac的專利技術(shù)1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis創(chuàng)立了一種不同于DELFIA的時(shí)間分辨熒光免疫分析，即FIAgen2003年，時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)獲國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)當(dāng)前5頁，總共22頁?；驹砣齼r(jià)稀土離子包括有銪(Eu)，釤（Sm)，鋱

(Tb)，鏑

(Dy)等，它們的熒光光譜具有特異性強(qiáng)﹑Stokes位移大﹑壽命長的特點(diǎn)DELFIA采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)為雙功能螯合試劑，其一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質(zhì)的-NH2連接。在中性或接近中性pH條件下，DTTA與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強(qiáng)液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放出來并與增強(qiáng)液中的配體螯合﹑進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu3+熒光得以成千萬倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA為標(biāo)記物，通過檢測其與過量Eu3+形成的螯合物熒光進(jìn)行定量。由于BCPDA的可檢測性不夠理想，F(xiàn)IAgen需要利用生物素-親合素信號(hào)放大來彌補(bǔ)BCPDA檢測靈敏度的不足當(dāng)前6頁，總共22頁。DELFIA標(biāo)記技術(shù)堿性當(dāng)前7頁，總共22頁。時(shí)間:(μs）04008001000340nm激發(fā)光第二個(gè)循環(huán)熒光短壽命熒光613nm長壽命熒光延遲時(shí)間測值時(shí)間通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使理論本底達(dá)到0當(dāng)前8頁，總共22頁。300400500600熒光強(qiáng)度激發(fā)光發(fā)射光波長(nm)當(dāng)前9頁，總共22頁。TbDyEuSm500發(fā)射光強(qiáng)度2004000延遲時(shí)間(μs)600發(fā)射光波長(nm)500發(fā)射光強(qiáng)度0延遲時(shí)間(μs)當(dāng)前10頁，總共22頁。TRFIA技術(shù)特點(diǎn)極長的熒光衰退時(shí)間

銪：730000ns

Stokes位移大

銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm狹窄的發(fā)射峰解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍當(dāng)前11頁，總共22頁。固相包被抗體銪標(biāo)記抗體孵育Eu待測抗原++EuEu+增強(qiáng)液+Eu雙抗體夾心法示意圖當(dāng)前12頁，總共22頁。雙抗原夾心法示意圖Eu++孵育+Eu孵育增強(qiáng)液+Eu固相包被抗原待測抗體銪標(biāo)記抗原當(dāng)前13頁，總共22頁。中和法示意圖(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增強(qiáng)液++Eu待測抗體銪標(biāo)記抗體中和抗原當(dāng)前14頁，總共22頁。小分子抗原競爭抑制示意圖固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待測抗原銪標(biāo)抗原Eu增強(qiáng)液++Eu一抗當(dāng)前15頁，總共22頁。時(shí)間分辨技術(shù)重點(diǎn)和難點(diǎn)固定相（96孔板）標(biāo)準(zhǔn)品銪標(biāo)記物當(dāng)前16頁，總共22頁。二、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

測試儀當(dāng)前17頁，總共22頁。目前的TRFIA測試儀：國外儀器（Wallac公司<PerkinElmer>）國內(nèi)其他公司生產(chǎn)的儀器(上海新波、廣州豐華等)達(dá)瑞抗體公司自主研發(fā)的儀器及軟件（DR-M6601）當(dāng)前18頁，總共22頁。WallacAutoDELFIA1235當(dāng)前19頁，總共22頁