檢測技術(shù)及梅毒實驗室檢測技術(shù)

窗口期HIV感染后的血清學(xué)動態(tài)Anti-P24HIVRNA感染1周2周3周4周………………1年2年3年………..10年………..急性期潛伏期Anti-gp41/120(anti-gp36)Ag艾滋病期Ab濃度當(dāng)前1頁，總共39頁。試驗室假陰性報告的原因分析窗口期非典型血清學(xué)轉(zhuǎn)換病毒變異實驗室誤差實驗室進行艾滋病抗體篩查很很多的原因可能造成漏檢,曾經(jīng)有文獻具體分析過造成漏檢的原因,主要原因有因為窗口期的原因造成漏檢,因為病毒變異以及實驗室誤差等原因造成的漏檢.其中最主要的原因是因為窗口期的問題造成的漏檢.占整體比例的93.7%.

當(dāng)前2頁，總共39頁。篩查試驗復(fù)核檢測確證試驗檢測程序及流程圖當(dāng)前3頁，總共39頁。

HIV抗體篩查檢測流程樣品初篩試驗篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗報告陰性

當(dāng)前4頁，總共39頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）化學(xué)發(fā)光法快速檢測及其它檢測

明膠顆粒凝集試驗（PA）

免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗電化學(xué)發(fā)光試驗其它快速篩查試驗方法艾滋病唾液尿液檢測試劑初篩檢測方法當(dāng)前5頁，總共39頁。酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)

最早用于檢測血清中HIV抗體的有效篩檢方法；很高的敏感性和特異性；

HIV抗體檢測試劑根據(jù)其抗原的來源和檢測方式可分為四代；根據(jù)檢測方法，可分成四類間接法、雙抗原夾心法、競爭法和捕獲法。當(dāng)前6頁，總共39頁。（1）膠體金（膠體硒）法（2）明膠凝集法（3）斑點印跡試驗（4）電化學(xué)發(fā)光法快速檢測方法當(dāng)前7頁，總共39頁。（1）膠體金法原理：采用雙抗原夾心法免疫測定原理，使用純化HIV-1/2基因重組抗原，分別固定于硝酸纖維膜上，作為檢測線，并且用這些抗原標(biāo)記膠體金。當(dāng)待檢樣本中存在HIV抗體時，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用向前移動，當(dāng)遇到膜上固定的抗原時，形成Ag-Ab-Ag-AU復(fù)合物而富集在包被線上，形成一條或二條紅色線，是陽性結(jié)果。反之，若標(biāo)本中不存在HIV抗體，則不會出現(xiàn)紅線，是陰性結(jié)果。無論樣本中是否含有HIV抗體，在質(zhì)控線區(qū)域都會形成另一條紅色線。

T-檢測線C-質(zhì)控線當(dāng)前8頁，總共39頁。1.準(zhǔn)備試劑與相關(guān)耗材2.每個樣本檢測用一片試劑，標(biāo)上相應(yīng)樣本編號.

3.加入50μl全血或血清和血漿4.5-20分鐘讀取結(jié)果

5.讀取和記錄檢測結(jié)果.

當(dāng)前9頁，總共39頁。陽性反應(yīng)：在質(zhì)控窗和反應(yīng)窗均顯示紅線。陰性反應(yīng)：只在質(zhì)控窗出現(xiàn)紅線，反應(yīng)窗沒有紅線。無效：在質(zhì)控窗沒有出現(xiàn)紅線，說明檢測無效，需要重新檢測。當(dāng)前10頁，總共39頁。第四代試劑

聯(lián)合檢測HIVP24抗原和抗HIV抗體電化學(xué)發(fā)光法當(dāng)前11頁，總共39頁。第一代艾滋病抗體檢測試劑檢測的是HIV-1的IgG抗體,檢測的窗口期大約是42天.第二代試劑可以檢測HIV-1和HIV-2型的IgG抗體窗口期縮短至35天.第三代的試劑可以同時檢測IgG和IgM抗體,將檢測的窗口期又縮短至22天.第四代的可以聯(lián)合檢測HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗體的試劑,大約平均比較第三代試劑縮短6天時間.

當(dāng)前12頁，總共39頁。ElecsysHIVCombi的檢測原理羅氏第四代HIVCombi試劑檢測的是HIVP24抗原和HIV-1/HIV-2抗體.檢測P24抗原使用的是單克隆的HIV抗體.檢測HIV-1/2抗體使用的是大量的重組抗原,來捕捉IGg和IGM抗體.

釕生物素辣根過氧化物酶標(biāo)記的磁性珠電化學(xué)發(fā)光當(dāng)前13頁，總共39頁?？焖贆z測法的優(yōu)先使用

技術(shù)角度需要考慮：需要快速得到結(jié)果、免去試劑和樣本的冷鏈運輸環(huán)節(jié)、小空間實驗室的成本效益、檢測的簡單性等。

優(yōu)先使用包括：應(yīng)急、門診急診，如VCT、母嬰傳播、臨床評估、農(nóng)村血檢、術(shù)前檢測、緊急事件等。當(dāng)前14頁，總共39頁。HIV快速檢測的局限性一般不用于血液篩查有一定的假陽性反應(yīng)窗口期問題：有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時間<3個月）HIV抗體快速檢測具有快速優(yōu)勢，但是“快速”并不意味著對早期感染者的快速診斷，因為HIV感染后產(chǎn)生抗體應(yīng)答需要一段時間，存在窗口期（即從暴露至最早檢測出的時間），即使采用分子生物學(xué)試驗，也有1～2周的窗口期。當(dāng)前15頁，總共39頁。陰性－－報告“HIV抗體陰性”陽性－－出具“HIV抗體待復(fù)查”報告（1）不能出陽性報告。（2）同時盡快進行以下處理：

在廣州市疾病預(yù)防控制中心數(shù)字化信息系統(tǒng)填寫送檢病例信息，打印送檢單，重新采血，兩份血和紙質(zhì)版送檢單一并送篩查中心或確證實驗室；做檢測后咨詢；初篩陽性告知。（注意告知技巧）

篩查檢測結(jié)果的報告和處理當(dāng)前16頁，總共39頁?？贵w篩查試驗的局限性陽性結(jié)果需用其他試劑復(fù)查以及確證。陰性結(jié)果有時不能排除HIV感染:(1)在感染早期，血清陽轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測不到（如p24抗體）。

(2)反應(yīng)中抗體過量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝集抑制。當(dāng)前17頁，總共39頁。艾滋病實驗室生物安全生物安全細則職業(yè)暴露的防范當(dāng)前18頁，總共39頁。梅毒實驗室檢測技術(shù)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗科詹鈾超當(dāng)前19頁，總共39頁。主要內(nèi)容實驗室檢測注意事項及臨床意義梅毒實驗室檢測策略探討當(dāng)前20頁，總共39頁。常用梅毒實驗室檢測方法病原學(xué)檢測血清學(xué)檢測當(dāng)前21頁，總共39頁。病原學(xué)檢查原理：一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。方法：（1）暗視顯微鏡檢查（2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測（血液標(biāo)本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功， 僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。當(dāng)前22頁，總共39頁。梅毒血清學(xué)檢測方法1)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 （非特異性梅毒抗體）(2)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。當(dāng)前23頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。當(dāng)前24頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理方法包括：（1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR)（2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）（3）性病研究實驗室試驗(VDRL)等?；境煞质切牧字蚜字湍懝檀伎乖贵w結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似當(dāng)前25頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理示意圖當(dāng)前26頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速100r/min，轉(zhuǎn)幅約18mm2、定性試驗加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原（60滴/mL，1滴=17ul）反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23℃-29℃）亮光下觀察結(jié)果。當(dāng)前27頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗操作要點3、定量試驗稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。下同定性實驗。1:11:21:8當(dāng)前28頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗臨床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性。非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。當(dāng)前29頁，總共39頁。非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗特點假陽性反應(yīng)技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗即可排除。生物學(xué)假陽性反應(yīng)(一般滴度小1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗如TPPA等進行排除。當(dāng)前30頁，總共39頁。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。當(dāng)前31頁，總共39頁。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(RT)熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）當(dāng)前32頁，總共39頁。TPPATPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。TPPA是目前WHO公認的梅毒抗原血清學(xué)試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用于新方法、新試劑的參照標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前33頁，