修飾動物模型的建立及應(yīng)用

修飾動物模型的建立及應(yīng)用第1頁/共83頁核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第2頁/共83頁復(fù)性RNADNA第3頁/共83頁核酸分子雜交的原理

帶有某種標(biāo)記的核酸單鏈作為探針，在一定條件下，按堿基互補(bǔ)配對原則與互補(bǔ)的核酸單鏈退火形成雙鏈雜交體，鑒定靶序列的存在、分子大小或進(jìn)行靶序列的相對定量分析。

第4頁/共83頁核酸分子雜交的雜交動力學(xué)

核酸分子雜交

核心序列形成自發(fā)過程

第5頁/共83頁（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)

探針(probe)第6頁/共83頁

探針的來源

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針第7頁/共83頁二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

第8頁/共83頁

其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交

(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)第9頁/共83頁

核酸雜交技術(shù)（一）SouthernBlot原理用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點突變、擴(kuò)增重排等。

第10頁/共83頁

SouthernBlot操作步驟：DNA瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或顯色第11頁/共83頁第12頁/共83頁斑點印跡雜交(Dotblot)斑點印跡

優(yōu)點簡單、迅速；核酸粗提、多樣品檢測

缺點不確定分子量、特異性不高，假陽性第13頁/共83頁原位雜交（InSituhybridization）

標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核酸中的互補(bǔ)序列雜交。

1969,Pardue--爪蟾核糖體基因探針

1970,Orth兔乳頭狀瘤病毒cDNA探針

第14頁/共83頁WesternBlot原理第15頁/共83頁

操作過程SDS電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影第16頁/共83頁

Hours04816

WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3/Bcl-2.Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol.

第17頁/共83頁注意的問題蛋白質(zhì)電泳常用SDS非變性PAGETris-Tricine膠中電泳聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套第18頁/共83頁三種印跡技術(shù)的比較第19頁/共83頁分子雜交實驗①②③目錄第20頁/共83頁放射自顯影照片目錄第21頁/共83頁第22頁/共83頁

DNA芯片:（Bio-chip、DNAarrays、Oligonucleotidemicrochip)

特點：高度并行性，多樣性，微型化和自動化。

DNA芯片第23頁/共83頁AssayFormats

NormalSample1.ExtractgenomicDNAfromtissue4.HybridizetoChip5.WashandImage2.LabelGenomicExpression1.ExtractmRNAfromtissue2.ProducecDNAbyRT&Label4.HybridizetoChip5.WashandImage3.MixwithlabeledreferenceDNA3.MixwithlabeledreferencecDNATumorSample第24頁/共83頁DNAmicrarrayrobotenclosedinatemperatureandhumiditycontrolledenvironment.

第25頁/共83頁第26頁/共83頁第27頁/共83頁ResearchUse——

FromSequencetofunction

計算Ratio值(=Cy3/Cy5)

在0.5-2.0之外的定義為在兩樣本中有明顯差異表達(dá)。進(jìn)而獲取初步功能信息。

Clustering第28頁/共83頁

芯片雜交結(jié)果示意圖第29頁/共83頁DNA點陣目錄第30頁/共83頁DNA芯片技術(shù)的主要應(yīng)用①分析基因組、發(fā)現(xiàn)新基因②基因表達(dá)的研究③DNA序列分析④基因診斷⑤基因藥物設(shè)計第31頁/共83頁第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction第32頁/共83頁

PCR技術(shù)發(fā)展簡史(1)PCR的最早設(shè)想(2)PCR的實現(xiàn)1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis

等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。(3)PCR的改進(jìn)與完善第33頁/共83頁

耐熱的DNA聚合酶TaqDNA聚合酶于1988年saiki從嗜熱水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分離出來。該菌株于1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離到?；蛉L2,499bp，編碼分子量為94kd、長度為832個氨基酸的蛋白質(zhì)。第34頁/共83頁聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理PCR是KaryMullis于1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程,即利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等在體外條件下，催化一對引物間的特異DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。第35頁/共83頁5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目錄第36頁/共83頁Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄第37頁/共83頁模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分第38頁/共83頁三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第39頁/共83頁PCRthermalcyclers第40頁/共83頁

平臺期與平臺效應(yīng)（plateaueffect）

PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的對數(shù)累積趨于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，而是進(jìn)入線性增長期或靜止期，此過程稱為平臺效應(yīng)。

第41頁/共83頁

PCR通用操作程序①

向一微量離心管中依次加入：雙蒸水補(bǔ)至終體積（終體積20～100μl）10×PCR緩沖液1/10體積2mmol/LdNTP1/10體積引物各10～50pmolDNA模板102～105拷貝TaqDNA聚合酶0.2～2.5U混勻后，離心數(shù)秒。第42頁/共83頁②

加礦物油50～100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā),于PCR儀上設(shè)置程序，置反應(yīng)管于PCR儀上，進(jìn)行熱循環(huán)。③瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。第43頁/共83頁第44頁/共83頁（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途第45頁/共83頁三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)第46頁/共83頁

原位PCR(In-situPCR)

原位PCR是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟片包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。

第47頁/共83頁實時PCR技術(shù)原理目錄第48頁/共83頁第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis第49頁/共83頁核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)第50頁/共83頁一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。第51頁/共83頁二、DNA鏈末端合成終止法第52頁/共83頁目錄第53頁/共83頁三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

第54頁/共83頁DNA自動測序結(jié)果舉例目錄第55頁/共83頁基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)第56頁/共83頁基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。第57頁/共83頁基因組DNA文庫目錄第58頁/共83頁疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)第59頁/共83頁克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)第60頁/共83頁定義從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。第61頁/共83頁克隆方式

①利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。

功能互補(bǔ)試驗(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。

第62頁/共83頁（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。第63頁/共83頁（三）非定位候選基因克隆策略

由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。第64頁/共83頁（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。第65頁/共83頁第六節(jié)

遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第66頁/共83頁轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)第67頁/共83頁目錄第68頁/共83頁核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)第69頁/共83頁基因剔除技術(shù)也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)第70頁/共83頁四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動物模型①單基因決定疾病模型

基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型第71頁/共83頁第七節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology第72頁/共83頁DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)一、基因芯片基因芯片(gene