人類染色體疾病的診斷三

關(guān)于人類染色體疾病的診斷三第一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日染色體顯帶技術(shù)的優(yōu)缺點染色體顯帶是細胞遺傳學分析技術(shù)中不可替代的基本方法。“金標準”操作簡便，經(jīng)濟可以提供核型的完整圖像影響因素：染色體相似性很強，復雜畸變時；或畸變微?。ㄈ缛笔?lt;5Mb)，不足以引起圖像明顯變化時，結(jié)果分析困難。耗時（培養(yǎng)需72小時）且依賴于獲得良好的分裂相，而有的標本中分裂指數(shù)低，或染色體形態(tài)學表型差。

第二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日一、FISH原理（一）、幾個概念雜交原位雜交熒光原位雜交依據(jù)DNA雙鏈堿基互補、變性和復性原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補的同源核酸序列，這一過程叫做雜交。原位雜交(insituhybridization)是用已標記的核酸探針與組織切片或細胞中的待測核酸中的互補序列雜交,從而對組織細胞中的核酸進行定性、定位和相對定量分析。第三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日原位雜交1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)——70年代2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)——80年代中后期（1）免疫酶聯(lián)（2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)**同位素原位雜交的不足：1）不穩(wěn)定；2）高背景；3）曝光時間長；4）結(jié)果統(tǒng)計學處理繁瑣;5）同位素的使用和處理第四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日熒光原位雜交（FISH）

FISH技術(shù)是常規(guī)染色體分析的輔助手段。它是用熒光素標記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號來判斷結(jié)果。它可用于標記染色體的識別、特異融合基因的檢測，并可廣泛用于腫瘤的診斷分型，新基因定位，用全染色體涂抹探針識別復雜的染色體結(jié)構(gòu)異常等。第五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日原理：通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應基因的情況。第六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日第七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日二、FISH的優(yōu)點：1.操作簡便，探針標記后穩(wěn)定，一次標記后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到結(jié)果。3.在同一標本上，可同時幾種不同探針，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復雜核型。4.不僅可用于分裂細胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于靜止期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。第八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日三、FISH探針

用生物素或地高辛標記稱為間接標記。

雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號。優(yōu)點：在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應擴大缺點步驟較多,操作麻煩。（一）、直接標記和間接標記第九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日直接用熒光素標記DNA的方法稱為直接標記。優(yōu)點：由于直接標記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號,省去了煩瑣的免疫熒光反應。由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高,直接標記的熒光探針應用越來越多。第十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日探針標記在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標探針。通常用Biotin標記的探針應大于100bp，較小的探針可采用PCR技術(shù)來標記。近年來，VYSIS公司成功的生產(chǎn)了大片段的DNA探針（100─400kb）。由于探針較長，故可將熒光物質(zhì)直接標記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進一步簡化面且雜交信號增強。第十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日（二）、FISH探針的種類1）單拷貝探針：（1）種類：酵母人工染色體（YAC），細菌人工染色體（BAC），Cosmid，Plasmid，cDNA片段（2）應用（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗證；（b）確定染色體微小缺失與重復；（c）染色體斷裂點分析。第十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日２）簡單重復序列探針(simplerepetitiveprobes）其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色體的著絲粒，異染色質(zhì)區(qū)域和端粒，重復數(shù)百次至數(shù)千次。特點：信號強應用：(a)標記染色體識別(b)染色體數(shù)目異常檢測(c)同時由于G顯帶時，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測，而應用端粒探針則彌補了G顯帶的不足第十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日3）染色體涂染探針（chromosomepaintingprobes)整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針包括通過流式細胞儀（FACS）分選或顯微切割獲得的全染色體，染色體臂，或染色體特異性區(qū)帶涂抹探針應用：檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。第十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日四、FISH的臨床應用

第十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日1.在細胞遺傳學檢查中，重復序列的探針應用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質(zhì)周圍。經(jīng)典衛(wèi)星DNA有著AATGG短片段，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長臂異染色質(zhì)周圍，后兩處探針除了可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細改變的檢查。第十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日染色體著絲粒熒光第十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日染色體端粒熒光第十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH檢測18三體及Turner綜合征結(jié)果

左圖：18（藍色）X(綠色)Y（紅色）探針，顯示18號、X和Y染色體為正常；

中圖：18三體綜合征病例的FISH結(jié)果，有三個藍色信號（18號）；

右圖：Turner綜合征病例的FISH結(jié)果，1個綠色信號（X單體）

第十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH檢測21三體綜合征結(jié)果

左圖：以13（綠色）21（紅色）為探針，顯示13號和21號染色體為正常；

中圖及右圖：21三體綜合征病例的FISH結(jié)果，有三個紅色信號（21號）。第二十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日對于臨床來說，對母血清唐氏篩查異常的高危孕婦，可以考慮選擇FISH檢測。

因為血清學篩查主要針對21、18、13一三體發(fā)病風險的統(tǒng)計，80％的常見染色體異常發(fā)生在2l、18、l3、X及Y這5對染色體，而FISH針對這些血清學異常已達到很高的特異性及敏感性，且FISH的快速簡便，可以極大的緩解孕婦的焦慮情緒。晚孕期的的孕婦也建議使用FISH檢測。

因為晚孕期羊水培養(yǎng)失敗率較高，而臍血穿刺流產(chǎn)的風險較高，選擇FISH檢測快速用于臨床診治指導，減輕孕婦的焦慮及負擔。

第二十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH檢測與傳統(tǒng)核型分析相比具有對孕周無嚴格要求，快速，簡便，需要樣本量小，可以檢測微小缺失等優(yōu)點，但它也有僅能檢出部分染色體數(shù)目異常，不能檢出染色體結(jié)構(gòu)異常的缺點。

第二十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日2.血液病檢測大部分白血病存在某種染色體易位，產(chǎn)生新的融合基因，編碼新的融合蛋白。利用這些標志可以診斷不同類型的白血病。特殊染色體異常往往同時有特征性的形態(tài)學異常和獨特的臨床特點，染色體核型與AML患者的預后和治療密切相關(guān)，因此細胞遺傳學在WHO分型中占據(jù)了重要地位。例如：WHO2001年建議，急性白血?。ˋML）被劃分為以下四組：

(1)急性髓系白血病伴重現(xiàn)性染色體異常；(2)急性髓系白血病伴有多系細胞增生異常；(3)治療相關(guān)的急性髓系白血病與骨髓增生異常綜合征；(4)不能歸類的急性髓系白血病。第二十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日

檢查初始治療

HLA配型體格檢查SouthernBCR-ABL陰性

血小板、血細胞記數(shù)Ph1陰性WesternBMTa

生化全套PCR成人CML骨穿±活檢FISHBCR-ABL陽性慢性期形態(tài)學觀察幼稚細胞百分比進行起始治療（CML-2）嗜堿性細胞百分比

核型分析

Ph1陽性a

NCCN:國家綜合腫瘤網(wǎng)腫瘤學臨床實踐指導

2004年第一版

慢性髓性白血病2004年第一版第二十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日細胞遺傳學和血液學緩解的標準1血液學完全緩解末梢血完全正常，白細胞<10×109/L

血小板<450×109/L

末梢血中沒有不成熟細胞象髓細胞、早幼粒細胞及幼稚細胞。沒有疾病的癥狀及體征和重新出現(xiàn)的可觸及的脾腫大。細胞遺傳學緩解2

完全緩解：沒有Ph陽性的分裂象部分緩解：1%-34%Ph陽性的分裂象輕微緩解：35%-90%Ph陽性的分裂象部分血液學緩解同完全血液學緩解相同除外：存在幼稚細胞血小板較治療前減少50%，但>450×109/L

持續(xù)脾大但范圍小于治療前的50%。1摘自FaderiD等所著：《慢性粒細胞白血病：生物學及治療》。發(fā)表于AnnInternMed131:207-219,1999。2至少檢查20個分裂象。第二十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日腫瘤基因變異（或統(tǒng)稱突變）的發(fā)生是一個累積的和概率的過程。我們每個人體內(nèi)都在發(fā)生著突變，實際上大多數(shù)突變是無意義的，因此，一個腫瘤患者基因組內(nèi)可能有很多變異，可以表現(xiàn)為不同的形式。有的是決定意義的，比如BCR-ABL1融合基因；有的也有一定的輔助意義，如復雜的染色體異常或特定的基因變異。不僅腫瘤的發(fā)生是一個動態(tài)過程，腫瘤發(fā)生后它的基因組也在持續(xù)的發(fā)生著動態(tài)的變化。一旦出現(xiàn)了新的有意義的突變，還會導致疾病的進展。如部分CML患者發(fā)病時只能看到和檢測到BCR-ABL1融合基因，但發(fā)生急變時就能看到復雜的染色體異?；騃KZF1基因的變化。實際上是由于后來發(fā)生了更多的基因的異常，才導致了CML進展為急性白血病。第二十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH檢測不需要進行細胞培養(yǎng)，是臨床遺傳學檢測的有效補充手段：

傳統(tǒng)的染色體檢查方法周期長，人工消耗大，而且染色體分析需要有較好質(zhì)量的中期分裂相。白血病患者腫瘤細胞中期分裂相不易獲得，而且有些重要預后意義的累及基因位點的微缺失或僅存在于間期細胞中的異常，傳統(tǒng)的細胞遺傳學技術(shù)是不能檢測出來的。

熒光原位雜交技術(shù)不需要中期分裂相，因此可分析大量間期細胞，且具有操作相對簡單、重復性好、敏感性和特異性高的優(yōu)點。但需要指定基因特異性的探針，失去了核型分析的宏觀性。第二十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日Translocationt(9;22)(q34;q11)第二十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日Translocationt(9;22)(q34;q11)第二十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日在正常的細胞中，兩個紅點和兩個綠點分別表示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正常的細胞中，BCR-ABL融合基因呈現(xiàn)為紅綠兩種顏色的融合，這種融合基因常常在觀察中顯示為黃色熒光（箭頭所指）。第三十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日五、幾種新技術(shù)介紹第三十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日1.多色熒光原位雜交（M-FISH）采用全染色體探針（WCP）與染色體雜交，分析染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常的分子生物學方法。探針是經(jīng)過聚合酶鏈反應(Degenerateoligonucleotideprimedpolymerasechainreaction,DOP-PCR)擴增、流式分選、并用5種熒光素組合熒光標記法標記的同源染色體。這種經(jīng)過標記的探針集合(Pool)與制備好的間期細胞染色體雜交,可使雜交后的每條染色體表現(xiàn)出獨有的顏色,從而能夠分辨出人的22對常染色體和X、Y兩條性染色體(圖2[15]),雜交后的圖像通過濾光裝置被計算機獲得并分析得出結(jié)果。如果一條染色體的顏色不相同,則提示該條染色體有重組現(xiàn)象,根據(jù)每條染色體各自獨有的顏色,可以知道哪幾條染色體之間進行了重組[第三十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日M-FISH對染色體間復雜易位的分析有突出優(yōu)勢,但是對染色體微小易位(<1MB)的分析則受到限制,而對染色體內(nèi)部異常的分析則無能為力,這包括染色體的擴增、微小缺失和倒位第三十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日染色體光譜核型比對分析技術(shù)（SKY-spectral-karyotyping)-創(chuàng)新的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常檢查工具原理：光譜核型分析SKY經(jīng)由CCD相機擷取圖像，利用光譜干涉儀及傅立葉轉(zhuǎn)換技術(shù)，分辨獲得圖像每一像素點的光譜，以此標定出不同光譜的不同顏色。優(yōu)勢：對比傳統(tǒng)的M-FISH,光譜核型分析技術(shù)的采用優(yōu)勢無法比擬。一傳統(tǒng)的技術(shù)使用顯微鏡熒光濾鏡來分辨熒光信號，缺點存在嚴重的熒光信號干擾（cross-talk),信號重疊，信號位移等，無法有效分辨染色體，也無法準確診斷染色體的細微變異，異位。而SKY完全克服以上缺點，對圖像每一像素的光譜標以不同顏色，顯而易見。二從成本上看，不需要電動顯微鏡，熒光濾鏡僅使用一顆SKY濾鏡，SKYPaint探針做一次雜交，一次圖像擷取，讓使用人員減輕時間，精力，同時獲取穩(wěn)定結(jié)果。第三十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日第三十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日4.比較基因組雜交

ComparativeGenomicHybridization(CGH)

原理：在熒光原位雜交基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜交技術(shù)而發(fā)展起來的技術(shù)，主要用于腫瘤的檢測及其基因組分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是檢測整個腫瘤基因組DNA增加或減少的強有力的工具第三十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日比較基因組雜交（CGH）CGH不需要制備患者的染色體標本,只需采用腫瘤患者的基因組DNA和正常人的基因組DNA作為探針，與正常人的中期染色體分裂相進行雜交。比較兩種探針所標的熒光信號的強度比率來判斷腫瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或復制。因而CGH最適合于檢測實體瘤,淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標本的疾病.CGH另一無法替代的優(yōu)點是,它可在一次雜交中檢測整個基因遺傳物質(zhì)的增加或減少,但精度有限,對微小的擴增或缺失檢測不出,僅適用于對整個基因組進行篩查.CGH也無法發(fā)現(xiàn)平衡染色體易位.第三十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日比較基因組雜交原理示意

腫瘤DNA和對照DNA在染色體上的相對結(jié)合量取決于兩種DNA標本中相應雜交序列的多少因此可根據(jù)不同熒光強度的比率而定量分析腫瘤基因組中DNA的增加或丟失等比混合第三十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日比較基因組雜交過程第三十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日DAPI4’,6-二聯(lián)脒-2-吲哚苯FITC異硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基羅丹明人染色體不同熒光素染色結(jié)果第四十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日數(shù)字化圖像第四十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FITC/TRITC熒光強度比率分析圖RatioimageFITC/TRITC第四十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日第四十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日比較基因組雜交應用范疇可在基因組水平上對染色體變異部位進行準確的定量定位分析；不需要細胞培養(yǎng)可對腫瘤基因組DNA的拷貝數(shù)進行定性分析與定量分析；對細胞遺傳學難以判斷的腫瘤染色體的某些成分（如雙微體、標記染色體）的來源進行鑒定；快速檢出染色體三體性、單體性和部分染色體大片段重復的拷貝數(shù)變化，有利于對先天畸形、自然流產(chǎn)等疾病進行快速診斷。第四十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)勢：

可快捷檢測中期、間期基因組不需預先知道DNA發(fā)生改變的部位一次實驗即可檢出待測樣本整個基因組拷貝數(shù)的增減第四十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日多色信號采集常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標記探針的應用，使用CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲存在計算機內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個復合的多顏色的圖像。第四十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合對已做過G顯帶的染色體片子用75%的乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨認各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復雜的易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近G帶外理過的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細胞遺傳學家做出回顧性分析。第四十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期日FISH技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合FISH技術(shù)和RFLP結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形或復雜片段的性質(zhì)。FISH