豬鏈球菌的檢測(cè)課件

豬鏈球菌的檢測(cè)九江市疾病預(yù)防控制中心梁劍鋒2011年8月15日一、病原學(xué)

二、發(fā)病機(jī)制三、流行病學(xué)

四、臨床表現(xiàn)

五、預(yù)防與控制

六、病原學(xué)鑒定

七、鑒別診斷

人感染豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（streptococcussuis）感染人而引起的人畜共患性疾病。從事豬的屠宰及加工等人員為高危人群，本病主要通過皮膚的傷口而感染。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、食欲下降等一般細(xì)菌感染癥狀，重癥患者可合并中毒性休克綜合征（toxicshocksyndrome,TSS）和鏈球菌腦膜炎綜合征（streptococcusmeningitissyndrome,SMS）。鏈球菌分類：1、根據(jù)溶血現(xiàn)象分類1）甲型溶血性鏈球菌：稱甲型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。多為條件致病菌。2）乙型溶血性鏈球菌：稱乙型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解，致病力強(qiáng)。3）丙型鏈球菌：無溶血環(huán)，一般不致病。豬鏈球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血現(xiàn)象均不明顯)，某些菌株在馬血培養(yǎng)基上β溶血。鏈球菌分類：根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的分類蘭氏分類：按多糖類抗原（C抗原）將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群)，近年又增加U、V群，共20群，每個(gè)群有1個(gè)或多個(gè)種。一、病原學(xué)

豬鏈球菌屬鏈球菌（streptococcus）科，革蘭染色陽性，呈球形或卵圓形。鏈球菌科有30個(gè)以上的菌屬，分類有數(shù)種方法，根據(jù)鏈球菌蘭斯菲爾德（Lancefield）分類法，將豬鏈球菌分到了R、S、T群。近年根據(jù)細(xì)菌莢膜多糖抗原的差異，將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型，即1～34型和1/2型，其中1/2型為同時(shí)含有1型和2型抗原的菌株。2型豬鏈球菌主要是R群，而1型豬鏈球菌主要是S群。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道感染人的豬鏈球菌分別是2型、1型和14型，尤以2型為常見，也是最常被分離到的豬鏈球菌型別，其他兩個(gè)型別僅有個(gè)案報(bào)道。

2、毒力因子目前認(rèn)為，較為重要的豬鏈球菌毒力因子主要有：

1）莢膜多糖（CPS）：是目前惟一被確認(rèn)的，也是最為重要的毒力因子。

2）溶菌酶釋放相關(guān)蛋白（muramidase-releasedprotein,MRP）和細(xì)胞外蛋白因子（extracellularfactor,EF）：除莢膜多糖外，這兩種蛋白是最常用于評(píng)價(jià)豬鏈球菌毒力的指標(biāo)。3）豬鏈球菌溶血素（suilysin）：溶血素被認(rèn)為是幾種細(xì)菌的主要毒力因子，可能在豬鏈球菌侵入和裂解細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用。

4）44000蛋白、IgG結(jié)合蛋白及其他因素：44000蛋白為2型豬鏈球菌的胞壁蛋白，IgG結(jié)合蛋白屬熱休克蛋白，有報(bào)道認(rèn)為也與毒力相關(guān)。菌毛(fimbriae)、黏附因子(adhesions)也是一些細(xì)菌常見的毒力因子。

3、MLST分析對(duì)我國江蘇和四川省人感染豬鏈球菌病爆發(fā)期間分離到的菌株，進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（multilocussequencetyping,MLST），證實(shí)均為序列7型（MLST7型）。

人感染豬鏈球菌臨床主要有兩種嚴(yán)重表現(xiàn)形式，即SMS和TSS。SMS的主要病理表現(xiàn)是化膿性腦膜炎，腦膜血管充血明顯，并有大量中性粒細(xì)胞浸潤，而其他臟器的病理改變輕微。

TSS的特征是敗血癥休克合并DIC，病理表現(xiàn)為全身多器官、組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性和壞死，以及不等量的中性粒細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)血管明顯充血、漏出性出血，毛細(xì)血管內(nèi)微血栓（透明血栓）形成。主要受累器官的表現(xiàn)為：①皮膚、黏膜（胃腸道、呼吸道及泌尿生殖道）與漿膜出現(xiàn)瘀點(diǎn)和瘀斑；心、肝、腎、腎上腺、食管和腸道等臟器出血，血液不凝固，顏色鮮紅；部分器官（肺、腎）毛細(xì)血管內(nèi)有數(shù)量不等的微血栓（透明血栓）形成，后者呈PTAH染色陽性，支持為纖維蛋白性血栓。②肺充血、水腫，灶性和片狀出血，以及毛細(xì)血管內(nèi)微血栓形成。③急性脾炎。④肝臟輕度腫大，肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶性或片狀壞死。⑤腎臟充血、出血，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)數(shù)量不等的微血栓形成。⑥心肌纖維變性、點(diǎn)狀壞死及炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)血管充血伴多灶性出血。⑦漿膜腔積液，如胸腔、心包腔和腹腔積液等。病變以肺、腎臟和心臟為甚，而腦和腦膜的病變不明顯。⑧有的病例可見皮膚有傷口，常見于手臂與足等處。

重癥豬鏈球菌感染者可合并DIC。病理表現(xiàn)為全身多器官、組織內(nèi)毛細(xì)血管漏出性出血，血液不凝固，繼而導(dǎo)致多器官功能衰竭和休克。

休克是強(qiáng)烈的致病因子作用于機(jī)體引起的全身危重病理過程，多種原因可致休克。重癥人感染豬鏈球菌病患者發(fā)生休克應(yīng)是多種原因所致，包括①某些炎性介質(zhì)的作用引起靜脈和毛細(xì)血管擴(kuò)張，致血管總?cè)莘e增加；②DIC致廣泛性毛細(xì)血管漏出性出血使血容量減少；③心肌病變致心輸出量減少等。

SMS患者，因腦脊髓膜血管高度擴(kuò)張充血，蛛網(wǎng)膜下腔增寬，大量中性粒細(xì)胞、纖維蛋白及液體滲出導(dǎo)致腦脊液量增加，而引起顱內(nèi)高壓，患者可有頭痛、噴射狀嘔吐以及病理征陽性等癥狀和體征。因顱神經(jīng)受累，患者可有不同程度的聽力障礙，甚至永久性耳聾。2、傳播途徑

人感染豬鏈球菌主要因接觸被豬鏈球菌感染的生豬和未加工的豬肉制品，經(jīng)皮膚破損的傷口或眼結(jié)膜而感染。是否能通過呼吸道，借助氣溶膠由病豬而感染人仍有待深入研究。3、人群易感性

人群普遍易感。直接接觸感染的?。ㄋ溃┴i或豬肉制品的人群為高危人群，有皮膚破損者極易發(fā)病。國外多數(shù)學(xué)者認(rèn)為人感染豬鏈球菌病是人類一種重要的動(dòng)物源性職業(yè)病。免疫功能缺陷的人群感染豬鏈球菌，往往病癥較重。

4、流行特征

本病的流行特征還不完全清楚，人感染豬鏈球菌病常伴隨豬群中鏈球菌病的爆發(fā)而高度散發(fā)，已報(bào)道的人感染豬鏈球菌病例常發(fā)生于夏季。豬間豬鏈球菌感染的擴(kuò)散可能與高溫潮濕的環(huán)境密切相關(guān)，因此高溫潮濕也很可能是間接導(dǎo)致人感染豬鏈球菌病夏季發(fā)病增加的因素。人感染豬鏈球菌病與性別、年齡沒有必然聯(lián)系，但與職業(yè)有很大關(guān)系，從事豬的養(yǎng)殖或者是參與豬的屠宰、加工、配送、銷售及烹調(diào)的人員均屬高危人群，尤其是宰殺?。ㄋ溃┴i者危險(xiǎn)性更大。

1）感染中毒癥狀：高熱、畏寒、寒戰(zhàn)，伴頭痛、頭暈、全身不適、乏力等。

2）消化道癥狀：食欲下降、惡心、嘔吐，少數(shù)患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉。

3）皮疹：皮膚出現(xiàn)瘀點(diǎn)、瘀斑，部分病例可出現(xiàn)口唇皰疹。

4）休克：血壓下降，末梢循環(huán)障礙。

5）中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染表現(xiàn)：腦膜刺激征陽性，重者可出現(xiàn)昏迷。

6）呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)：部分嚴(yán)重患者繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），出現(xiàn)呼吸衰竭表現(xiàn)。

7）聽力、視力改變：聽力下降，視力下降，且恢復(fù)較慢。

8）其他：少數(shù)患者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、化膿性咽炎、化膿性淋巴結(jié)炎等，嚴(yán)重患者還可出現(xiàn)肝臟、腎臟等重要臟器的功能損害。

五、預(yù)防與控制

人感染豬鏈球菌病的預(yù)防控制應(yīng)以疫情監(jiān)測(cè)、嚴(yán)格控制傳染源、切斷傳播途徑等綜合性防治措施為主。

1、疫情監(jiān)測(cè)

各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)，尤其在已經(jīng)發(fā)生動(dòng)物疫情和曾經(jīng)發(fā)生人感染豬鏈球菌病疫情的地區(qū)及周邊地區(qū)，要開展對(duì)不明原因發(fā)熱病例的監(jiān)測(cè)。接診可疑不明原因發(fā)熱患者必須詢問流行病史，如發(fā)現(xiàn)有病（死）豬接觸史，應(yīng)在積極治療的同時(shí)，立即向當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告。2、管理傳染源

應(yīng)在當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門的指導(dǎo)下，對(duì)病（死）家畜進(jìn)行消毒、焚燒、深埋等無害化處理。嚴(yán)禁屠宰、加工、販賣病（死）家畜及其制品。

3、切斷傳播途徑

1）對(duì)直接接觸（如宰殺、洗切加工、搬運(yùn)等）感染的病（死）豬或豬肉制品的人員，開展為期1周的醫(yī)學(xué)觀察，主要觀察體溫變化，一旦出現(xiàn)發(fā)熱應(yīng)立即就診。

2）做好疫點(diǎn)的消毒處理。對(duì)患者家庭及其畜圈、禽舍等區(qū)域和患者發(fā)病前接觸的?。ㄋ溃┴i所在家庭及其畜圈、禽舍等疫點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行消毒處理。

患者的排泄物、分泌物、嘔吐物等應(yīng)用消毒液消毒。

3）根據(jù)實(shí)際情況，劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)，必要時(shí)采取一定管制措施。

4、保護(hù)易感人群

1）個(gè)人防護(hù)

動(dòng)物疫情發(fā)生地的生豬屠宰、加工、銷售等從業(yè)人員或其他相關(guān)人員應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)工作，特別是從事動(dòng)物疫情處理的工作人員應(yīng)采取嚴(yán)格的個(gè)人防護(hù)措施。

從事人感染豬鏈球菌病例調(diào)查、采樣、臨床救治、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和消毒工作的醫(yī)務(wù)衛(wèi)生人員均應(yīng)采取嚴(yán)格的個(gè)人防護(hù)措施，嚴(yán)防發(fā)生感染。2）藥物預(yù)防

對(duì)直接接觸感染的?。ㄋ溃┴i或豬肉制品的人員可用阿莫西林進(jìn)行預(yù)防性服藥，每次0.5g，每天3次，連服3天。

3）健康教育

采取多種形式開展健康宣傳教育，向群眾宣傳傳染病和人畜共患病防治知識(shí)，告知群眾不要宰殺、加工、銷售、食用病（死）家畜。5、流行病學(xué)調(diào)查

發(fā)現(xiàn)人感染豬鏈球菌病疫情后，疫情發(fā)生地縣級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要立即組織開展流行病學(xué)調(diào)查，在最短時(shí)間內(nèi)對(duì)所報(bào)告病例進(jìn)行核實(shí)，進(jìn)行個(gè)案調(diào)查。六、病原學(xué)鑒定

豬鏈球菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要是對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)所獲得的菌株分離后進(jìn)行生化鑒定、血清分型以及特異性基因檢測(cè)。目前尚無成熟的特異性抗體檢測(cè)方法。

1．標(biāo)本采集及病原體分離

采集患者的血液、腦脊液或尸檢標(biāo)本，直接接種于豬鏈球菌最佳培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)分離。如條件所限，不能立即接種，應(yīng)4℃保存或冷藏送檢，爭(zhēng)取及時(shí)培養(yǎng)。1）樣品采集對(duì)病豬，最急性和急性病例可無菌采集死亡豬的心、肝、肺、腎、脾臟、淋巴結(jié)等組織，慢性病例如關(guān)節(jié)炎型一般采取關(guān)節(jié)液及周圍組織；對(duì)活豬可采取扁桃體拭子、鼻腔拭子。2）分離培養(yǎng)①送檢菌株的分離劃線接種于普通瓊脂綿羊血平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，如茵落生長緩慢，可延長至48h±2h，使之形成單個(gè)菌落，以供鑒定用。②病料的分離和觸片檢查用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)蘸取病料內(nèi)部組織后劃線接種于普通瓊脂綿羊血平板，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，如菌落生長緩慢，可延長至48h±2h后觀察。同時(shí)取病料做組織觸片，姬姆薩染色（按GB/T4789.28的方法進(jìn)行染色）后鏡檢，如見球菌則表明病料中可能含有鏈球菌。③扁桃體和鼻腔拭子的分離扁桃體和鼻腔拭子樣品加入到含有SmL滅菌的選擇性THB增菌液的試管中，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后，劃線接種于選擇性普通瓊脂綿羊血平板。④動(dòng)物產(chǎn)品的均質(zhì)、增菌和分離以無菌操作取檢樣25g，加入裝有225mL滅菌選擇性THB增菌液的廣口瓶內(nèi)，均質(zhì)，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后，劃線接種于選擇性普通瓊脂綿羊血平板。3）初步鑒定豬鏈球菌2型在36℃培養(yǎng)24h后，在普通瓊脂綿羊血平板和選擇性普通瓊脂綿羊血平板上形成圓形、微凸、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的菌落，直徑約0.3mm-lmm，大多數(shù)菌株呈α溶血，部分菌株產(chǎn)生β溶血。將可疑菌落做革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。本菌為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑約1μm，固體培養(yǎng)物以雙球菌為多，少量呈3個(gè)-5個(gè)排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以鏈狀為主，無芽孢，能形成莢膜（按GB/T4789.28的方法進(jìn)行染色）。本菌過氧化氫酶試驗(yàn)均為陰性。菌落生長特征、革蘭氏染色、菌體形態(tài)和過氧化氫酶試驗(yàn)符合者，可初步確定為鏈球菌。革蘭染色鏡下成對(duì)出現(xiàn)，革蘭氏陽性鏈球菌

豬鏈球菌顯微鏡形態(tài)

豬鏈球菌鮮血瓊脂培養(yǎng)菌落形態(tài)

羊血平皿：α溶血

2．生化鑒定

對(duì)分離到的菌株應(yīng)用API生化鑒定系統(tǒng)的Api20-step手工鑒定條及Vitek-compact2或其他生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，可直接鑒定到種。

經(jīng)初步鑒定后，做5%乳糖、海藻糖、七葉苷、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉等糖發(fā)酵試驗(yàn)。豬鏈球菌2型發(fā)酵5%乳糖和海藻糖產(chǎn)酸，發(fā)酵七葉苷，不發(fā)酵甘露醇和山梨醇，不水解馬尿酸鈉。

3．血清分型

對(duì)經(jīng)過生化鑒定的菌株用豬鏈球菌1～34型血清或用單克隆抗體進(jìn)行分型。實(shí)驗(yàn)方法：取1滴鏈球菌分型血清或單克隆抗體懸滴于載玻片上，與1滴菌懸液充分混合，或用接種環(huán)刮取單個(gè)菌落直接與血清混合，觀察是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。

將可疑菌落接種THB肉湯（見第B．3章），于36℃±1c培養(yǎng)18h±2h，取1.5mL培養(yǎng)物，10000r/min離心3min，棄上清，用100μL生理鹽水將沉淀懸浮，取25μL菌體懸浮液分別和等體積的25μL生理鹽水、豬鏈球菌2型陽性血清作玻片凝集試驗(yàn)，其中生理鹽水作為稀釋液對(duì)照并觀察待檢菌株是否有自凝現(xiàn)象。同時(shí)設(shè)陽性菌株對(duì)照。在生理鹽水對(duì)照不凝集，陽性菌株凝集的情況下，待檢菌株出現(xiàn)凝集為陽性反應(yīng)。4．PCR基因鑒定

挑取分離純化的菌落或選擇平板上濕潤的可疑菌落，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行鏈球菌屬特異性引物（tuf）、豬鏈球菌種特異性、豬鏈球菌2型莢膜多糖基因（cps2j）、豬鏈球菌溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段（mrp）及豬鏈球菌溶血素基因（sly）檢測(cè)。對(duì)已經(jīng)大量使用抗菌藥物治療的患者，可將采集標(biāo)本直接進(jìn)行PCR法檢測(cè)，確認(rèn)豬鏈球菌種特異性基因（16SrRNA），以及特有的毒力基因，若為陽性者則作為確診病例。基因鑒定，使用PCR技術(shù)和對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析檢測(cè)豬鏈球菌種特異性16SrRNA。

上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat

下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

檢測(cè)豬鏈球菌莢膜多糖基因（cps2j）

上游引物：gttgagtccttatacacctgtt

下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

檢測(cè)溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段（mrp）

上游引物：ggtataccttgctggtaccgttc

下游引物：agtctctacagctgtagctgg

PCR反應(yīng)的條件：

94℃預(yù)變性5分鐘;94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，25個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃、5分鐘。取5微升擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2℅的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。5、檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施1）抽樣和制樣過程抽樣和制樣工具，應(yīng)清洗干凈，121℃、15min-20min滅菌，一套清潔工具限于一個(gè)樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)該經(jīng)過清洗、滅菌，或?yàn)橐淮涡詼缇萜鳌?)檢測(cè)過程①PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)、PCR區(qū)、后PCR區(qū)。將模板提取、PCR反應(yīng)液配制、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)作應(yīng)從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”單方向進(jìn)行。②實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服和戴手套，手套要經(jīng)常更換。各區(qū)要有專用實(shí)驗(yàn)服，經(jīng)常清洗。③各區(qū)所有的試劑、器材（尤其是移液器）、儀器都應(yīng)專用，不得帶出該區(qū)。④所有溶液、水、耗材和器具要121℃、15min-20min滅菌，避免核酸和（或）核酸酶污染。每種溶液應(yīng)使用高質(zhì)量的成分和新蒸餾的雙蒸水。在20℃-25℃貯存的試劑中，可加0.025%的疊氮鈉。所有試劑應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。⑤裝有DNA模板或引物的離心管打開之前，要簡(jiǎn)短離心，離心管不能用力崩開，以免產(chǎn)生氣溶膠。⑥茼PCR區(qū)中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反應(yīng)各組分。⑦實(shí)驗(yàn)前后，實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA。⑧可使用UDG和dUTP系統(tǒng)控制污染。⑨檢測(cè)過程中的廢棄物，應(yīng)收集后高壓滅菌處理。6、符合以下特性者應(yīng)判為豬鏈球菌2型；——豬鏈球菌2型在36℃培養(yǎng)24h后，在普通瓊脂綿羊血平板和選擇性普通瓊脂綿羊血平板上形成圓形、微凸、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的菌落，直徑約0.3mm-lmm，大多數(shù)菌株呈a溶血，部分菌株產(chǎn)生p溶血；——革蘭氏陽性球菌，單個(gè)、成對(duì)或成鏈存在；——過氧化氫酶試驗(yàn)陰性；

——發(fā)酵5%乳糖和海藻糖產(chǎn)酸，發(fā)酵七葉苷，不發(fā)酵甘露醇和山梨醇，不水解馬尿酸鈉（本試驗(yàn)項(xiàng)目具有不確定性，鑒定時(shí)供參考），或法國生物一梅里埃公司AP120Strep生化鑒定系統(tǒng)鑒定為豬鏈球菌2型者；——與豬鏈球菌2型陽性血清玻片凝集試驗(yàn)陽性；——豬鏈球菌2型定型PCR檢測(cè)陽性。7、符合以下特性者的菌株可判定為致病性豬鏈球菌