2015年公開課講課用微生物實驗室培養(yǎng)

微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等無細胞結構真核細胞細菌、藍藻原核細胞◆微生物的共同特點：個體微小、結構簡單第一頁，共68頁。1.細菌的形態(tài)第二頁，共68頁。擬核，大型環(huán)狀DNA質粒(小型環(huán)狀DNA，含抗生素等抗藥性和固氮的基因)其成分為肽聚糖2.細菌的結構特殊結構第三頁，共68頁。細菌主要是以二分裂的方式進行增殖（如右圖）3.細菌的繁殖第四頁，共68頁。芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。（抗逆性極強）注：不是繁殖體第五頁，共68頁。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.第六頁，共68頁。

真菌是通過產生大量的孢子來繁殖后代的，霉菌的直立菌絲頂端生有孢子，蘑菇的菌褶處也生有孢子，孢子隨風飄散，在適宜的環(huán)境條件下，能發(fā)育成一個新個體。單細胞的酵母菌還可進行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是無性生殖。

第七頁，共68頁。課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應用第八頁，共68頁。培養(yǎng)微生物需要解決的兩個問題是什么？1、為其提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件2、防止雜菌的入侵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件無菌技術(獲得純凈培養(yǎng)物）思考:第九頁，共68頁。1.何為培養(yǎng)基？3.不同的培養(yǎng)基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些營養(yǎng)元素？有何作用？請舉例說明。閱讀教材P14~15相關內容，回答以下問題：

2.按照不同的培養(yǎng)基劃分標準，培養(yǎng)基有哪些種類、配制特點及其應用？一、培養(yǎng)基第十頁，共68頁。（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質1.培養(yǎng)基概念

第十一頁，共68頁。2.培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據物理性質分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據化學成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基據用途分常用于工業(yè)生產常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數用化學成分不明確的天然物質配成如加入血清血漿等根據細胞生存所需要的種類和數量用人工方法模擬合成在培養(yǎng)基中加入（或缺少）某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產物就與伊紅和美藍結合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。含有一般微生物生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)物質（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）第十二頁，共68頁。液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第十三頁，共68頁。半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)第十四頁，共68頁。固體培養(yǎng)基：菌落第十五頁，共68頁。單個或少數菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌落鑒定菌種的重要依據固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體第十六頁，共68頁。幾種菌落及其形態(tài)第十七頁，共68頁。幾種菌落及其形態(tài)第十八頁，共68頁。3.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-糖類等含碳有機物質

自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-、N2

、NH3牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：有機C源為異養(yǎng)型微生物提供碳源和能源含CHON的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源N2（固氮微生物的唯一氮源）NH3（既是硝化細菌的氮源又是能源）硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用

不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方第十九頁，共68頁。特殊營養(yǎng)物質：生長因子(3)常見的生長因子：(1)概念：(2)作用：微生物生長不可缺少的微量有機物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。

一些天然物質如酵母膏、蛋白胨、動植物組織提取液等可為微生物提供生長因子（4）來源：第二十頁，共68頁。注意：最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽對異養(yǎng)生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白質之所以補充生長因子，是由于缺少合成這些物質的酶或合成能力有限第二十一頁，共68頁。此外，還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質（如:生長因子)以及氧氣等的要求。第二十二頁，共68頁。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)構成？第二十三頁，共68頁。

牛肉膏是用新鮮牛肉經過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。牛肉膏主要含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質類及維生素類的水溶性物質。此外含硫氨酸較多，而且含有更多的細菌生長需要的維生素和其它生長因子，是生物制藥發(fā)酵及和種培養(yǎng)基制備的基礎原材料。

蛋白胨是有機化合物。蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，在抗生素、醫(yī)藥工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生化制品及微生物學科研等領域中的用量均很大。第二十四頁，共68頁。選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌（抑制細菌、放線菌的生長）分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物第二十五頁，共68頁。4.配制原則

⑴目的明確：⑵營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當⑶適宜的pH值：有機碳源異養(yǎng)型：根據微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產科研第二十六頁，共68頁。C課堂練第二十七頁，共68頁。２.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是()A．碳源B．氮源C．無機鹽D．特殊營養(yǎng)物質A課堂練第二十八頁，共68頁。1.何為無菌技術？無菌技術包括哪些方面？2.什么是消毒？滅菌？兩者有何區(qū)別？3.常用的消毒與滅菌的方法有哪些？有何要求？4.請說出干熱滅菌法和高壓蒸汽滅菌法的操作步驟。二、無菌技術閱讀教材P15-P16相關內容，回答以下問題：

第二十九頁，共68頁。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是什么？二、無菌技術防止外來雜菌污染1.目的：2.方法：消毒與滅菌消毒與滅菌的概念和區(qū)別？第三十頁，共68頁。

（１）消毒定義：

利用較為溫和的化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。

2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

第三十一頁，共68頁。

（2）滅菌的定義：

以強烈的化學劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。滅菌與消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。第三十二頁，共68頁。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min

或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用70%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第三十三頁，共68頁。1、灼燒滅菌(2)滅菌的方法：第三十四頁，共68頁。2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第三十五頁，共68頁。

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好，加棉塞時，應使棉塞長度的2／3在試管口內，如上圖所示。加棉塞第三十六頁，共68頁。第三十七頁，共68頁。高壓蒸氣滅菌的原理是（）A．高壓使細菌DNA變性B．高壓使細菌蛋白質凝固變性C．高溫燙死細菌D．高溫使細菌DNA變性B第三十八頁，共68頁。關于滅菌和消毒的不正確的理解是A．消毒和滅菌實質上是相同的B．滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細胞、芽孢和孢子C．接種環(huán)用燒灼的方法滅菌D．常用滅菌方法有加熱法、過濾法、紅外線法、化學藥品法A第三十九頁，共68頁。1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考第四十頁，共68頁。2.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程二.無菌技術：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：酒精燈旁操作超凈工作臺第四十一頁，共68頁。三、實驗操作（大腸桿菌的純化培養(yǎng)）（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）第四十二頁，共68頁。1．計算、稱量2．溶化3．調pH：pH7．6

4．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。5．加塞6．包扎操作步驟第四十三頁，共68頁。包器材第四十四頁，共68頁。包器材第四十五頁，共68頁。7．滅菌:

將裝有培養(yǎng)基的三角錐瓶，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃下滅菌2h。

8．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.9．無菌檢查：

將滅菌的未接種（或者接種無菌水）的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第四十六頁，共68頁。第四十七頁，共68頁。（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法微生物的接種技術：原理：想方設法在培養(yǎng)基上得到由一個細菌繁殖而來的肉眼可見的菌落，即獲得較純的菌種。第四十八頁，共68頁。涂布器接種環(huán)接種針第四十九頁，共68頁。三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌（目的）⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復實驗）（空白對照）第五十頁，共68頁。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。第五十一頁，共68頁。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第五十二頁，共68頁。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液第五十三頁，共68頁。第五十四頁，共68頁。⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼冷涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第五十五頁，共68頁。問題討論涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第五十六頁，共68頁。⑴平板劃線法：三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄第五十七頁，共68頁。接種方法的判斷？？？第五十八頁，共68頁。四.菌種的保藏：1.臨時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃第五十九頁，共68頁。本課題知識小結:第六十頁，共68頁。【典例解析】例:關于微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的是()A.是碳源的物質不可能同時是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無機物只提供無機鹽

D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。D第六十一頁，共68頁。例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是()A.防止雜菌污染

B.消滅雜菌

C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌

D.滅菌必須在接種前解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關的所有設備和物質都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。B第六十二頁，共68頁。編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.（提示：金黃色葡萄球菌具耐鹽性）自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

第六十三頁，共68頁。（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)成分共有

類。（5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化