葡聚糖凝膠柱的使用方法

葡聚糖凝膠柱的使用方法：預(yù)處理

ForuseonlyinstudySephadexG-25〔50－100目〕約5g，參加蒸餾水100mlandresearch3h進(jìn)展溶脹。裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲〔約200目尼龍布〕墊底或購置類似規(guī)格的商品柱。然后

;notforcialuse將柱垂直安裝好，先參加1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。同時(shí)大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必需均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必需到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡2－3h即可加樣品分別。加樣加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠外表相齊〔或留一極薄液層〕為止。然后，由柱的上端加水解液2ml，留意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，翻開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器2－3次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)展洗脫。洗脫與收集洗脫時(shí)，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)展，使凝膠柱上端保持肯定的液層，防0.8－1.0ml/min的收集承受分管連續(xù)挨次收集，每管收集3ml，共收集10管。據(jù)閱歷，4或5號(hào)管核苷酸濃度最大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋L度的差異，管號(hào)會(huì)有變化，必要時(shí)可A260nm，找出濃度最大的管號(hào)。(5)(5)凝膠的再生和回收凝膠柱使用一次后，必需反沖疏松一次，平衡后再使用。假設(shè)使用數(shù)次，就需要再生處理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。假設(shè)試驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃雙縮脲茚三酮烘箱中烘干，回收保存。試驗(yàn)五.葡聚糖凝膠層析【試驗(yàn)?zāi)康摹堪盐掌暇厶悄z的特性及凝膠層析的原理。學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的根本操作技術(shù)?！驹囼?yàn)原理】凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠〔Sephadex〕和瓊脂糖凝膠Sepharos。葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑—氯—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀構(gòu)造的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)整葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔構(gòu)造越嚴(yán)密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔構(gòu)造就越疏松，網(wǎng)孔的大小打算了被分別物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。可分別的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而最終從層析柱中流出。假設(shè)被分別物的分子量介于完全排阻和完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以到達(dá)分別目的。本試驗(yàn)以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分別藍(lán)色葡聚糖—2023和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚糖—20232×106670，二者分子量相差較大，前者完全排阻，而后者則可完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時(shí)間不同而分開?！驹囼?yàn)材料】試驗(yàn)器材層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；10m1；721型分光光度計(jì)試驗(yàn)試劑Tris—醋酸緩沖液(pH7.00.0lmol/LTris0.1mol/LKCl)900ml，用濃醋pH7.01000m1。105滴參加Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍(lán)色。藍(lán)色葡聚糖—2023溶液：稱取藍(lán)色葡聚糖—2023 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。0.1毫升，藍(lán)色葡聚糖—20230.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。葡聚糖凝膠G-25(Sephadex-G-25)【試驗(yàn)操作】4克葡聚糖凝G—2550毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時(shí)，或沸水浴溶脹2小時(shí)，一般沖溶液(pH7.0的Tris2—3pH及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口留氣泡，最終保存約2析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時(shí)，翻開下口螺旋夾，連續(xù)裝柱8厘米,關(guān)閉出口。裝柱過程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避開消滅分層。再用洗脫液平衡l2個(gè)柱床體積，凝膠面上始終保持有肯定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。20230.3流至與凝膠外表平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每3—4cm。洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)整洗脫液流速為每分鐘1毫升，進(jìn)展洗脫。認(rèn)真觀看樣品在層析柱內(nèi)的分別現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管(試管預(yù)先編號(hào))，收集約20管左右，樣品即可完全被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721540nm處測(cè)定其光密度。后，將柱下口放在小燒杯中，漸漸翻開，再將上口漸漸松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。2SephadexLH20的原理。SephadexLH20〔在反相溶劑中〕。由于凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保存弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保存強(qiáng)，最終出柱。假設(shè)使用反相溶劑洗脫，SephadexLH20對(duì)化合物還起反相安排的作用，所以極性大的化合物保存弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保存強(qiáng)，后出柱。假設(shè)使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分別。SephadexLH20洗脫溶劑。2SephadexLH2010050醇100％甲醇沖柱。SephadexLH20樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。假設(shè)樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫〔甲醇－－水〕，樣品用最少體積的甲醇－－水〔盡可能甲醇少一些〕溶解，過濾后，濕法上樣〔肯定要濾喔！要是把SephadexLH20堵啦，就得將SephadexLH20的柱頭局部棄去，很難過呀〕。假設(shè)樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫〔氯仿－－甲醇〕，樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。SephadexLH-20的步驟。選擇條件：梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們?cè)囼?yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。飽和層析柱：開關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。樣品處理：用完量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。洗脫：掌握流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時(shí)更改極性〔很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢〕。再生以備下次使用。分別的技巧，最終說說我的使認(rèn)真得流速不行太快，切切不行急，所謂欲速則不達(dá)。SephadexLH20柱長的增加將極大地改善分別，所不要吝惜填料，1／101／20個(gè)保存體積接成一餾分。2-3個(gè)保存體積，對(duì)特別保存強(qiáng)的化合物，可洗脫5個(gè)保存體積。鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)峻，如不在乎填料者，可用SephadexLH20分鞣質(zhì)SephadexLH20對(duì)黃酮類成分的分別效果極佳，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分別的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。SephadexLH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于自然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，PharmadexLH-20同時(shí)適用于分子類別格外相像的物質(zhì)的分別和工業(yè)規(guī)模的制備驟，也可用于最終精制步驟，如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分別。裝柱裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一〔粒徑分布越窄〕，越簡(jiǎn)潔獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于SephadexLH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對(duì)脹后就相對(duì)簡(jiǎn)潔得到均一的柱床。這對(duì)于長柱〔最高至250cm〕而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲(chǔ)槽都必需進(jìn)展徹底的清洗。SephadexLH-20在使用之前必需進(jìn)展溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避開過分?jǐn)嚢?，否則會(huì)破壞球形膠粒，且要避開使用磁力攪拌器。總體積的75%，上層溶劑占25%，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。1.5ba。平衡基線變得平穩(wěn)后的層析中柱平衡可以省略。洗脫液0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。樣品樣品體積應(yīng)當(dāng)占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應(yīng)當(dāng)離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。洗脫12cm/mi〔反壓1.5b1-10cm/總體來說，較低的流速，具有較高的分辯率。以下無正文僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、爭(zhēng)論；不得用于商業(yè)用途。только для людей, которые используются для обучения, исследованийи не использоватьсявкоммерческихцелях.Forpersonaluseonlyin