人類疾病模型與模式化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料淺談

模式化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料是確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病造模成功的關(guān)鍵因素之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料是維持該“試劑”標(biāo)準(zhǔn)化的重要基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被譽(yù)為活試劑，是一切疾病模型、毒理研究的載體。第一頁，共43頁。缺VD3飼料缺賴氨酸飼料缺鈣飼料高鈣飼料高鐵飼料高蛋白質(zhì)飼料缺鉻飼料模式化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料食源性肥胖模型飼料胰島素抵抗/糖尿病模型飼料非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型飼料動(dòng)脈粥樣硬化模型飼料高血壓模型飼料第二頁，共43頁。肥胖食源性肥胖癥高脂飼料誘導(dǎo)的食源性肥胖癥（DIO）遺傳與環(huán)境因素是肥胖的主因，飲食因素是誘發(fā)肥胖的主要環(huán)境因素。嚙齒類動(dòng)物在高脂誘導(dǎo)下很容易長(zhǎng)胖，是非常有效的食源性肥胖癥（Diet-InducedObesity,DIO）的研究工具[1,2]。第三頁，共43頁。肥胖食源性肥胖癥（DIO）高脂飼料誘導(dǎo)的DIODIO誘導(dǎo)飼料:30~45kcal%脂肪（粗脂肪13~18%，粗蛋白18~20%）高脂日糧

DIO對(duì)照飼料:10~11kcal%脂肪（粗脂肪4~5%，粗蛋白18~20%）低脂日糧飼喂該高脂料6~8周能引起大鼠、小鼠營養(yǎng)性肥胖，且大鼠伴隨高血脂和高血糖，小鼠伴隨高膽固醇和高血糖，為人類營養(yǎng)性肥胖伴發(fā)高脂血癥、高膽固醇血癥和高血糖提供了研究方便【3-4】。第四頁，共43頁。食源性肥胖造模常用飼料配方第五頁，共43頁。動(dòng)物模型

雖然大多數(shù)嚙齒類動(dòng)物在攝食高脂飼料后都會(huì)發(fā)胖，但是在體重增加、葡萄糖耐受水平、胰島素抗性、甘油三酯水平及其他生理指標(biāo)上存在品系差異性。小鼠高脂飼料近交易感品系小鼠：C57BL/6、AKR。

用58Kcal%脂肪的高脂飼料飼喂這兩種小鼠，體重增加相同，但C57BL/6比AKR對(duì)葡萄糖更加耐受[13]

。表現(xiàn)單一肥胖抵抗的小鼠品系：SWR/J、A/J[14,15]。封閉群的SD大鼠與Wistar大鼠是常用DIO品系，特別是SD大鼠。SD大鼠對(duì)32或45Kcal%脂肪的高脂飼料存在個(gè)體差異性，可用于肥胖（DIO）與肥胖抵抗（DR）的研究[16,17]。大鼠第六頁，共43頁。[18]如圖所示，隨著周齡的增加，DIO組與DR組的大鼠體重差異增大[18]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂或高脂高糖飼料造模結(jié)果只有部分可誘導(dǎo)成肥胖，約有一半的動(dòng)物存在食物抵抗，不能誘導(dǎo)成營養(yǎng)性肥胖[19]。第七頁，共43頁。幼年動(dòng)物對(duì)高脂食物更敏感，而年齡為70d～75d后的動(dòng)物對(duì)高糖食物所誘導(dǎo)的動(dòng)物體重增加敏感[19]。

高脂食物所誘導(dǎo)的肥胖還存在性別差異，這種差異主要表現(xiàn)為脂肪分布部位的不同。雌性動(dòng)物在腹內(nèi)及生殖器官周圍的脂肪墊所占比例大于雄性，而在前肢的比例較雄性小[19]。第八頁，共43頁。小結(jié)食源性肥胖造模以有很多成功的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)肥胖模型飼料的研究至今已有約20年歷史，形成了較為成熟的方法。肥胖癥研究的混雜因素很多，除了模型飼料的脂肪水平外，還包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、品系、性別、年齡等，而且約有50%的動(dòng)物存在食物抵抗。所以要得到足夠數(shù)量的模型動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本的數(shù)量需放大至少1倍。第九頁，共43頁。糖尿病胰島素抵抗/糖尿病高果糖/蔗糖飼料對(duì)嚙齒類動(dòng)物血脂水平與胰島素抵抗的影響胰島素抵抗（IR）是指胰島素靶組織對(duì)內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性與反應(yīng)性降低。IR不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，并且也與肥胖、高血壓和心血管疾病等密切相關(guān)。

目前IR模型以鼠類模型為主，按照建立方法的不同可以分為遺傳性模型、基因改造模型、誘發(fā)模型，其中誘發(fā)模型由于復(fù)制成功率高、穩(wěn)定、復(fù)制方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低、周期短，在國內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用[20]。第十頁，共43頁。IR常用造模動(dòng)物及模型飼料第十一頁，共43頁。*******注：SD大鼠，分別用對(duì)照料和不同加工方式高脂料飼喂6周后測(cè)定。Nor對(duì)照組、H1高脂料1——所用原料混勻，100oC烘烤2h；H2高脂料2——白糖+雞蛋混勻，100oC水蒸2h，再與其余原料混勻，繼續(xù)100oC水蒸2h；H3高脂料3——白糖+雞蛋混勻，100oC水蒸2h，再與其余原料混勻，100oC烘烤2h；3組高脂料配方相同[25]。糖與蛋白充分混勻并加熱的高熱量飼料更易于誘發(fā)IR美拉德反應(yīng)(Maillardreaction):是還原糖的羰基與氨基酸的氨基之間在加熱時(shí)發(fā)生的非酶催化的褐變反應(yīng)。該反應(yīng)是法國化學(xué)家Louis-CamilleMaillard于1912年在將甘氨酸與葡萄糖混合加熱時(shí)發(fā)現(xiàn)的，也稱為羰氨反應(yīng)。該反應(yīng)生成一系列的的糖化產(chǎn)物（AGEs）。人類及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明食入AGEs的量影響血AGEs水平，而高AGEs血癥可以影響機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致IR，促進(jìn)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[25]。第十二頁，共43頁。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。特點(diǎn)是人體自身能夠產(chǎn)生胰島素，但細(xì)胞無法對(duì)其作出反應(yīng)，使胰島素的效果大打折扣。Ⅱ型糖尿病第十三頁，共43頁。二型糖尿病造模動(dòng)物及模型飼料劉亞平[81]等2008年通過對(duì)Wistar大鼠的研究發(fā)現(xiàn)：通過給大鼠飼喂高脂高糖飼料（基礎(chǔ)料60%+豬油10%+蛋黃粉10%+蔗糖20%）8周，再結(jié)合小劑量注射鏈脲佐菌素（STZ，30mg/kg），可成功建立雄性大鼠2型糖尿病模型，而同等劑量，雌性模型需兩次注射STZ。雄、雌性糖尿病大鼠模型都具有高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗的特點(diǎn)造模成功率及穩(wěn)定性與性別有關(guān)，雄性大鼠較雌性大鼠成模率高，穩(wěn)定性好，且耗時(shí)更短。第十四頁，共43頁。湯球（2011）[82]在雄性SD大鼠中研究發(fā)現(xiàn)：給雄性SD大鼠飼喂高脂高糖飼料4周，第一次腹腔注射STZ30mg/kg，再過4周后第二次注射STZ40mg/kg，能夠成功制備T2DM大鼠模型，造模成功率為81.9%，死亡率為18.1%。第十五頁，共43頁。小結(jié)食物誘發(fā)的胰島素抵抗模型復(fù)制成功率高、穩(wěn)定、可靠，同時(shí)復(fù)制方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、周期短，在國內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。目前主要的胰島素抵抗模型飼料有：高脂飼料、高糖飼料、高脂高糖飼料。二型糖尿病造模的主要方法是：用高脂高糖飼料+小劑量的STZ注射。第十六頁，共43頁。脂肪肝脂肪肝非酒精性脂肪肝（NAFLD）non-alcoholicfattyliverdiaease

NASH與人類肥胖癥、胰島素抵抗、血脂異常及II型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)[27]。大部分肥胖癥患者都伴有肝臟脂肪變性[28,29]。第十七頁，共43頁。非酒精性脂肪肝模型動(dòng)物

NAFLD動(dòng)物模型采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、小型豬等，但主要以大鼠造模最為常見[80]。第十八頁，共43頁。非酒精性脂肪肝模型飼料嚙齒類動(dòng)物的脂肪肝可以用飼料進(jìn)行誘導(dǎo)。主要有3種飼料：MCD飼料（蛋氨酸-膽堿缺乏飼料）、CD飼料（膽堿缺乏飼料）和HFD飼料（高脂飼料）。第十九頁，共43頁。給SD大鼠飼喂MCD飼料2-4周可誘導(dǎo)嚴(yán)重非酒精性脂肪肝表型（肝臟脂肪變性、肝炎和肝纖維化）

[30,31]；體重減少，不會(huì)引起胰島素抵抗[32,33]。MCD飼料（蛋氨酸—膽堿缺乏飼料）：MCD飼料誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性的機(jī)制：蛋氨酸、膽堿缺乏磷脂酸膽堿合成減少VLDL分泌受阻甘油三酯出肝受阻脂肪浸潤(rùn)肝細(xì)胞（脂肪變性）[34]MCD飼料成分的改變：果糖比葡萄糖更有效誘導(dǎo)小鼠的肝細(xì)胞損傷[35]。飽和脂肪比非飽和脂肪能加速肝臟脂肪氧化并誘導(dǎo)促炎基因表達(dá)[35]。相對(duì)于奶油，橄欖油誘導(dǎo)肝臟甘油三酯堆積，魚油降低肝臟膽固醇水平[36]。第二十頁，共43頁。21給大鼠飼喂CD飼料7周后，血脂水平升高并誘發(fā)胰島素抵抗[37]。飼喂10周后，誘導(dǎo)肝臟脂肪變性、肝炎及肝損傷,且體重下降[37]。CD飼料（膽堿缺乏飼料）：第二十一頁，共43頁。HFD飼料（高脂飼料）：?誘導(dǎo)SD大鼠體重增加，體內(nèi)脂肪堆積及胰島素抵抗[38]。?不能誘導(dǎo)肝纖維化，只能誘導(dǎo)輕度的肝臟脂肪變性[27]。?添加膽固醇的HFD飼料，能誘導(dǎo)LDLR（-/-）小鼠肝臟脂肪水平升高并產(chǎn)生大小泡型脂肪變性[39]。?VD缺乏的HFD飼料能使SD大鼠NAFLD惡化[40]。?在35kcal%脂肪的HFD飼料中用中鏈甘油三酯替代長(zhǎng)鏈甘油三酯，可以阻止大鼠的肝脂肪變性[41]。?加果糖/蔗糖水的HFD飼料能誘導(dǎo)小鼠的肝纖維化[42]。?母體在妊娠期與哺乳期就進(jìn)行HFD飼喂的小鼠后代比那些離乳后才進(jìn)行HFD飼喂的小鼠對(duì)NASH的發(fā)病更加易感[43]。中鏈脂肪酸（MCFAs）比長(zhǎng)鏈脂肪酸（LCFAs）水解能力強(qiáng)6倍，且MCFAs水解對(duì)膽鹽和胰酶的依賴性較低，MCFAs的吸收不經(jīng)過淋巴系統(tǒng)而直接入血由肝門靜脈入肝，可以不依賴肉堿載體而直接進(jìn)入線粒體氧化供能。MCFAs幾乎不參與脂肪酸的從頭合成，在體內(nèi)很少沉積[91]。第二十二頁，共43頁。王倩等2007年用改良的高脂飼料（豬油10%+蔗糖5%+膽固醇2%+膽酸鈉0.5%+丙硫氧嘧啶0.2%+基礎(chǔ)飼料82.3%）飼喂SD大鼠5周能成功地構(gòu)建非酒精性脂肪肝大鼠模型，主要表現(xiàn)為大鼠體重與對(duì)照組無顯著差異，光鏡下可見肝細(xì)胞內(nèi)彌漫大量的脂肪空泡，電鏡證實(shí)肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴[92]。第二十三頁，共43頁。劉賀榮等2010用高脂飼料（豬油10%+膽固醇1.5%+豬膽鹽0.5%+基礎(chǔ)料88%）飼喂昆明小鼠6周，成功建立非酒精性脂肪肝模型。具體表現(xiàn)為小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹，肝組織內(nèi)可見彌漫分布的大脂滴和微脂滴并散布全肝[93]。第二十四頁，共43頁。小結(jié)嚙齒類動(dòng)物中的大鼠、小鼠是NAFLD很好的動(dòng)物模型，也是目前研究中常用的動(dòng)物模型。誘導(dǎo)NAFLD模型的飼料主要有高脂飼料、膽堿缺乏飼料、膽堿-蛋氨酸缺乏飼料三種。2023/3/31第二十五頁，共43頁。動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈粥樣硬化飼料誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化/高膽固醇血癥動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種復(fù)雜的慢性病，是指動(dòng)脈內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉積，并伴有纖維基質(zhì)成分和平滑肌的細(xì)胞增殖，逐步發(fā)展形成動(dòng)脈硬化性斑塊，斑塊部位的動(dòng)脈壁增厚、變硬，斑塊內(nèi)部的壞死組織與沉積的脂質(zhì)結(jié)合，形成粥樣物質(zhì)的過程[44]。第二十六頁，共43頁。模型飼料飼料誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化/高膽固醇血癥動(dòng)脈粥樣硬化的誘發(fā)因素之一是高膽固醇血癥（TC和LDL-C水平升高）。富含飽和脂肪（SF）與膽固醇的食物，如Western-typediets，能引起血液循環(huán)系統(tǒng)中的膽固醇（尤其LDL-C）水平升高[44]。

模型飼料：

西方飲食模型飼料。

高脂高膽固醇第二十七頁，共43頁。動(dòng)物模型小鼠：誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型常用轉(zhuǎn)基因小鼠：LDLR基因缺陷小鼠與apoE基因缺陷小鼠。含膽固醇（0.15%-1.25%重量比）不含膽酸的Western-typediets能在12周后誘導(dǎo)LDLR基因缺陷小鼠明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變[52]。Western-typediets誘導(dǎo)apoE基因缺陷小鼠出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化早期病變只需6周[53]。原理：這些小鼠體內(nèi)的突變體基因阻止了肝臟對(duì)血液循環(huán)系統(tǒng)中膽固醇的清除作用。第二十八頁，共43頁。動(dòng)物模型大鼠：Western-typediets(45kcal%脂肪，氫化椰子油、膽固醇1%，重量比、膽酸0.25%，重量比)飼料都能誘導(dǎo)大鼠TC及LDL-C水平的升高[47-49]，若要誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化還需添加0.5%的甲狀腺激素抑制劑(2-硫脲嘧啶)[50]。SD大鼠造模開始時(shí)一次性腹腔注射VD360萬IU.kg-1，并飼喂高脂飼料（10%豬油+5%白糖+3%膽固醇+0.5%膽酸鹽+0.2%丙基硫氧嘧啶+81.3%基礎(chǔ)飼料）8周，可建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。但該方法造模時(shí)大鼠的體重減輕,且死亡率達(dá)53%

（周永剛等，2011）。SD大鼠飼喂高脂模型飼料（1%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.1%甲巰咪唑+5%豬油+93.4%基礎(chǔ)料）2個(gè)月可建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[84]。VD3升高血漿鈣破壞動(dòng)脈內(nèi)皮加速血管壁脂沉積第二十九頁，共43頁。動(dòng)物模型基因突變大鼠：自發(fā)性基因突變大鼠（如JCR，LA-Corpulent）對(duì)食物中膽固醇敏感，能在沒有膽酸或甲狀腺激素抑制劑的參與下誘發(fā)高膽固醇血癥[51]。第三十頁，共43頁。動(dòng)物模型倉鼠：（含有膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白CETP，而大鼠、小鼠沒有）

CETP能將HDL微粒內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)移至血漿LDL微粒中。

富含膽固醇（0.5%，重量比）與飽和脂肪（15-20%奶油脂肪，重量比）的西方飲食模型飼料（Western-typediets）能在沒有膽酸的參與下在6周內(nèi)誘導(dǎo)倉鼠血漿TC和LDL-C水平的升高及明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變[55]。第三十一頁，共43頁。動(dòng)物模型豚鼠：豚鼠體內(nèi)含有膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白CETP[57]，西方飲食模型飼料能在沒有膽酸的參與下誘導(dǎo)豚鼠的膽固醇水平升高和動(dòng)脈粥樣硬化[58]。豚鼠對(duì)膳食脂肪酸成分變化高度敏感，富含飽和脂肪酸SF（棕櫚仁油）的高脂料中，添加0.3%膽固醇（重量比）可誘導(dǎo)豚鼠TC和LDL-C水平升高，在12周后誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[59-61]。高糖（42Kcal%）適度高脂（35Kcal%脂肪）高膽固醇（0.25%重量比）的飼料容易誘導(dǎo)豚鼠的動(dòng)脈粥樣硬化[62]。第三十二頁，共43頁。小結(jié)西方飲食模型飼料誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是目前廣泛應(yīng)用的模式化飼料。不同嚙齒動(dòng)物（如大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、基因敲除鼠）其造模特點(diǎn)不同，因此應(yīng)根據(jù)研究目的進(jìn)行選擇并配套相應(yīng)的模式化飼料。2023/3/31第三十三頁，共43頁。高血壓高血壓飼料誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物高血壓表型人類高血壓的發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)。高血壓研究首選的動(dòng)物模型是大鼠，包括選擇性培育的純合品系高血壓大鼠（自發(fā)性高血壓大鼠SHR、鹽敏感性高血壓大鼠DahlSS）與封閉群大鼠（SD大鼠）。第三十四頁，共43頁。高血壓高鈉飼料是常用的高血壓誘導(dǎo)飼料。LewisDahl等根據(jù)SD大鼠對(duì)8%NaCl飼料的不同響應(yīng)，從選擇性近親交配的SD大鼠中培育出了Dahl鹽敏感性（DahlSS，2-6周）與Dahl鹽抵抗性（DahlSR）大鼠模型[63]。動(dòng)物年齡在高血壓的鈉誘導(dǎo)中也起重要作用。SHR大鼠在5-6周齡就會(huì)自發(fā)性地血壓升高[64]。

在飼料中添加7%NaCl或1%生理鹽水能增加SHR大鼠的血管阻力，從而加劇SHR大鼠的血壓升高[65,66]。隨著血液循環(huán)系統(tǒng)中鈉水平的升高，細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)在滲透壓的作用下釋放至血液循環(huán)系統(tǒng)，從而引起血管壁受壓升高第三十五頁，共43頁。攝食4%NaCl純化飼料的DahlSS大鼠后代無論離乳后是否繼續(xù)攝食高鹽飼料，其血壓都是偏高的。這預(yù)示母體在妊娠內(nèi)過度攝食高鹽飼料可能會(huì)導(dǎo)致其后代患高血壓[68]。

NaCl含量正常,富含果糖或蔗糖(60Kcal%)的飼料能誘發(fā)高血壓動(dòng)物模型(DahlSS大鼠、SHR大鼠)的血壓升高[70-74]。影響高血壓表型的其他膳食因素第三十六頁，共43頁。粗飼料中的大豆（粗飼料常見蛋白質(zhì)來源）與純化飼料中的酪蛋白（純化飼料主要的蛋白質(zhì)來源）相比，大豆能抑制SHR大鼠的高血壓發(fā)病[69]。

減緩高血壓發(fā)病的飼料誘導(dǎo)方法：在飼料中補(bǔ)充額外的鉀鹽成分，可阻止由8%NaCl飼料誘發(fā)的高血壓的發(fā)生[76,77]。在飼料中添加抗氧化劑（維生素E、C），可使高血壓模型大鼠的血壓降低[78-80]。影響高血壓表型的其他膳食因素大豆蛋白含有植