生物氧化2課件

第三節(jié)氧化磷酸化一、概念二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比三、氧化磷酸化機(jī)理四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑五、線粒體穿梭系統(tǒng)六、氧化磷酸化的調(diào)控

一、概念生物體內(nèi)高能磷酸化合物ATP的生成主要由三種方式：

氧化磷酸化底物水平磷酸化光合磷酸化

底物水平磷酸化指ATP的形成直接與一個(gè)代謝中間物（PEP）上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的作用。

1、底物水平磷酸化特點(diǎn)：ATP的形成直接與中間代謝物進(jìn)行的反應(yīng)相偶聯(lián)；在有

O2或無O2條件下均可發(fā)生底物水平的磷酸化。1、P/O比：

1940年，SOchoa測定了在呼吸鏈中O2的消耗與ATP生成的關(guān)系，為此提出P/O比的概念。（同位素實(shí)驗(yàn)）當(dāng)一對(duì)電子經(jīng)呼吸鏈傳給O2的過程中所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。實(shí)質(zhì)是伴隨ADP磷酸化所消耗的無機(jī)磷酸的分子數(shù)與消耗分子氧的氧原子數(shù)之比,稱為P/O比。線粒體NADH+H+經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為2.5（3），F(xiàn)ADH2經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為1.5（2）。二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比

2、形成ATP的部位（氧化與磷酸化偶聯(lián)部位）電子傳遞鏈將NADH和FADH2上的電子傳遞給氧的過程中釋放自由能，供給ATP的合成。其中釋放大量自由能的部位有3處，即復(fù)合物Ⅰ(將NADH上的電子傳遞給CoQ的過程)、Ⅲ（將電子由CoQ

傳遞給細(xì)胞色素c的過程）、Ⅳ（將電子從細(xì)胞色素c傳遞給氧的過程），這3個(gè)部位就是ATP合成的部位，稱為偶聯(lián)部位。ATP的合成是由線粒體內(nèi)膜上的ATP合酶（復(fù)合體Ⅴ，H+-ATP酶）催化的。

能量計(jì)算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，總反應(yīng)為：NADH+H++1/2O2NAD++H2O求此反應(yīng)的ΔG0’：因?yàn)椋?/2O2+2H++2e-H2O,E0’=0.82vNAD++2H++2e-NADH+H+,E0’=-0.32v所以：ΔE0’=0.82-(-0.32)=1.14V

ΔG0’=-223.0631.14=-52.7(Kcal/mol)=-220.5(KJ/mol)3ADP+Pi3ATP+3H2OΔG0’=37.3=21.9(Kcal/mol)=91.6(KJ/mol)3個(gè)ATP的形成共截獲的能量為42%ΔG0’=-nFΔE0’線粒體的結(jié)構(gòu)外膜——平滑，含約50%脂類和50%蛋白，蛋白質(zhì)中有些可以形成孔道蛋白，能通過分子量小于4000~5000的物質(zhì)。內(nèi)膜——含約20%脂類和80%蛋白。它是細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)之間的主要屏障。內(nèi)膜有許多向內(nèi)的折疊，稱為嵴。嵴與嵴之間形成區(qū)室。內(nèi)膜上有許多球狀顆粒（內(nèi)膜球體），內(nèi)膜還含有許多富含蛋白質(zhì)的跨膜顆粒（如電子傳遞鏈顆粒、跨膜運(yùn)送顆粒等）。（1）化學(xué)偶聯(lián)假說（1953年）

chemicalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子傳遞反應(yīng)釋放的能量通過一系列連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)形成高能共價(jià)中間物，它們隨后裂解驅(qū)動(dòng)氧化磷酸化，即將其能量轉(zhuǎn)移到ADP中形成ATP。

（2）構(gòu)象偶聯(lián)假說（1964）

conformationalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子沿電子傳遞鏈傳遞使線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組分發(fā)生了構(gòu)象變化，形成一種高能構(gòu)象，這種高能形式通過ATP的合成而恢復(fù)其原來的構(gòu)象。迄今未能分離出這種高能蛋白質(zhì)。但在電子傳遞過程中蛋白質(zhì)組分的構(gòu)象變化還是存在的。

NADH呼吸鏈中的三個(gè)復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學(xué)梯度，也稱為質(zhì)子動(dòng)力。當(dāng)存在足夠的跨膜電化學(xué)梯度時(shí)，強(qiáng)大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學(xué)梯度蘊(yùn)藏的自由能釋放，推動(dòng)ATP的合成?；瘜W(xué)滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)內(nèi)膜和外膜間隙線粒體基質(zhì)線粒體內(nèi)膜支持化學(xué)滲透假說的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：氧化磷酸化作用的進(jìn)行需要封閉的線粒體內(nèi)膜存在。線粒體內(nèi)膜對(duì)H+OH-K+

Cl-都是不通透的。破壞H+

濃度梯度的形成（用解偶聯(lián)劑或離子載體抑制劑）必然破壞氧化磷酸化作用的進(jìn)行。線粒體的電子傳遞所形成的電子流能夠?qū)+

從線粒體內(nèi)膜逐出到線粒體膜間隙。大量直接或間接的實(shí)驗(yàn)證明膜表面能夠滯留大量質(zhì)子，并且在一定條件下質(zhì)子能夠沿膜表面迅速轉(zhuǎn)移。迄今未能在電子傳遞過程中分離出一個(gè)與ATP形成有關(guān)的高能中間化合物，亦未能分離出電子傳遞體的高能存在形式。

H+如何通過電子傳遞鏈“泵”出的？關(guān)于H+通過電子傳遞鏈“泵”出的兩種假設(shè)

（一般了解）氧化-還原回路機(jī)制(Mitchell提出）：線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的各個(gè)氧-還中心即FMNCoQCytC以及Fe-S中心的排列可能即執(zhí)行電子轉(zhuǎn)移又能轉(zhuǎn)移基質(zhì)的質(zhì)子。但是在電子傳遞鏈中，（H+e-）載體只有兩個(gè)即FMNCoQ，則三個(gè)ATP合成部位中還缺少一個(gè)（H+e-）載體，假設(shè)CoQ發(fā)揮兩次作用。（Q循環(huán)）質(zhì)子泵機(jī)制：電子傳遞導(dǎo)致復(fù)合體的構(gòu)象變化，而造成AA側(cè)鏈pK的變化，發(fā)揮質(zhì)子泵作用的側(cè)鏈暴露在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)（交替變化），從而使質(zhì)子發(fā)生移位。合成一個(gè)ATP，大約需要2-3個(gè)跨膜質(zhì)子。F1部分包括9個(gè)亞基，3個(gè)亞基、3個(gè)亞基及、、亞基個(gè)1個(gè)。亞基是催化ATP合成的部位，亞基連接FO和F1。FO上有離子通道和6個(gè)二環(huán)己基二亞胺（DCCD，DCC，DCCI）結(jié)合蛋白，這些蛋白圍成桶狀，具有離子通道，通道內(nèi)部有谷氨酸殘基（大腸桿菌是天冬氨酸殘基），這些殘基可與DCCD結(jié)合，從而抑制質(zhì)子通過FO。連接F1部分和FO部分是一個(gè)短柄，包含有兩種蛋白質(zhì)，寡霉素敏感性付與蛋白（OSCP）和偶合因子6（F6），寡霉素可與FO結(jié)合，抑制質(zhì)子通過FO。根據(jù)當(dāng)前最新測定,H+經(jīng)NADH-Q還原酶、細(xì)胞色素bc1復(fù)合體（Ⅲ）、細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）從基質(zhì)泵到膜外時(shí)，一對(duì)電子泵出的質(zhì)子數(shù)依次為4、2、4，而合成一個(gè)ATP分子是由2-3個(gè)H+通過ATP合酶所驅(qū)動(dòng)。所以電子從NADH傳至O2，共產(chǎn)生的ATP分子數(shù)是2.5個(gè)若從琥珀酸傳遞至O2，只有兩個(gè)偶聯(lián)部位，產(chǎn)生1.5個(gè)ATP。Fe-SFADH2琥珀酸-Q還原酶（復(fù)合體Ⅱ）1、特殊試劑的解偶聯(lián)作用某些化合物能消除跨膜的質(zhì)子濃度梯度或電位梯度，使ATP不能合成，這種作用稱為解偶聯(lián)作用，這類化合物成為解偶聯(lián)劑。解偶聯(lián)劑不抑制電子傳遞。不抑制底物水平的磷酸化。解偶聯(lián)劑主要有三種類型：化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚離子載體抑制劑：氧化磷酸化抑制劑：不同的化學(xué)因素對(duì)氧化磷酸化作用的影響方式不同，據(jù)此將它們分成三大類：四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑離子載體（離子載體抑制劑）是一類脂溶性物質(zhì)，能與H+以外的其他一價(jià)陽離子結(jié)合，并作為他們的載體使他們能過穿過膜，消除跨膜的電位梯度。纈氨霉素（K+）短桿菌肽（K+Na+）直接作用于ATP合酶復(fù)合體而抑制ATP合成的一類化合物。由于它干擾了由電子傳遞的高能狀態(tài)形成ATP的過程，從而間接抑制電子傳遞和降低O2的利用率。（區(qū)別于電子傳遞鏈抑制劑）寡霉素、雙環(huán)己基碳二亞胺（抑制FOF1某些蛋白的活性）寡霉素等對(duì)利用氧的抑制作用可被DNP解除。氧化磷酸化抑制劑線粒體呼吸的5種狀態(tài)（B.ChanceandGRWilliams）懸浮的線粒體實(shí)驗(yàn)：狀態(tài)I：無底物和ADP；狀態(tài)II：只有ADP狀態(tài)III：有底物和ADP狀態(tài)IV：有底物和再加入的ADP狀態(tài)V：氧被耗盡時(shí)，線粒體呼吸停止。解偶聯(lián)蛋白（產(chǎn)熱素）是存在于某些生物細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)，為天然解偶聯(lián)劑。它們能形成質(zhì)子通道，讓膜外的H+通過通道返回膜內(nèi)，消除跨膜質(zhì)子濃度梯度。如：動(dòng)物的褐色脂肪組織，其產(chǎn)熱機(jī)制是線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)的結(jié)果。

人、新生無毛的哺乳動(dòng)物以及冬眠的哺乳動(dòng)物。真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的NADH必須進(jìn)入線粒體才能經(jīng)呼吸鏈氧化并生成ATP.但NADH不能直接透過線粒體內(nèi)膜。需通過兩個(gè)穿梭途徑進(jìn)入。

磷酸甘油穿梭蘋果酸-天冬氨酸穿梭（肝﹑心中）五、線粒體穿梭系統(tǒng)（細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NADH的再氧化）2、蘋果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=3或2.5）蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸ⅠⅡ1243胞液膜間空間外膜內(nèi)膜基質(zhì)1、胞液的蘋果酸脫氫酶2、線粒體基質(zhì)的蘋果酸脫氫酶3、胞液的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶4、線粒體基質(zhì)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶Ⅰ、蘋果酸-α酮戊二酸反向交換載體

Ⅱ天冬氨酸-谷氨酸反向交換載體1動(dòng)物心臟及肝臟胞質(zhì)溶膠內(nèi)NADH利用此穿梭蘋果酸穿梭系統(tǒng)3、外NADH脫氫酶（真菌和高等植物）

NADH脫氫酶（復(fù)合物Ⅰ）內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，朝向基質(zhì)

催化線粒體內(nèi)部的NADH脫氫交給其輔基FMN

將氫傳遞給CoQ

外NADH脫氫酶內(nèi)膜外側(cè)，朝向膜間空間是一種以FAD為輔基的黃素蛋白，催化細(xì)胞液的NADH脫氫交給其輔基FAD將氫傳遞給CoQ，不經(jīng)過復(fù)合物Ⅰ，P/O比為2或1.5外膜內(nèi)膜膜間空間胞液基質(zhì)NADH+H+NADH+H+NAD+NAD+FPextFPintFe-SCoQcytbNADH+H+NAD+真菌和高等植物的胞液NADH進(jìn)入呼吸鏈氧化的途徑（P/O=2或1.5）FADFMN葡萄糖徹底氧化的能量計(jì)算：原核生物真核生物：不同組織EMP的能量計(jì)算也需考慮部位。六、氧化磷酸化的調(diào)控ADP是關(guān)鍵物質(zhì)。ADP作為關(guān)鍵物質(zhì)對(duì)于氧化磷酸化作用的調(diào)節(jié)稱為呼吸控制（respiratorycontrol）

當(dāng)細(xì)胞利用ATP做功時(shí)，AD