無(wú)參轉(zhuǎn)錄組報(bào)賬用結(jié)題報(bào)告

無(wú)參考組轉(zhuǎn)錄組背景概 項(xiàng)目概 實(shí)驗(yàn)流 RNA樣品檢 RNA文庫(kù)構(gòu) 文庫(kù)質(zhì) 4.1數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控 4.1.1堿基質(zhì)量 4.1.2堿基含量分 4.1.3質(zhì)量控 4.1.4數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量評(píng) mRNA片段化隨機(jī)性檢 Unigene功能注 SNP分 差異表達(dá)GO功能富 差異表達(dá)COG分 差異表達(dá)KEGG注 差異表達(dá)KEGG通路富集分 SVG文件格式的查 轉(zhuǎn)錄組（TranscriptomeSequencing）是對(duì)某一物種的mRNA進(jìn)行的高通量測(cè)高通量獲得cDN段兩端的序列，cDN段兩端測(cè)定的序列稱為雙端（Pair-endsReads）或Reads對(duì)于無(wú)參考組的物種，通過(guò)對(duì)得到的cDN段進(jìn)行組裝可以從頭獲得該物種的轉(zhuǎn)錄本（RA）序列，為非模式生物的各種轉(zhuǎn)錄組及其他研究奠定基礎(chǔ)通過(guò)組裝得到的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建物種的Unigene庫(kù)并基于此進(jìn)行包括結(jié)構(gòu)注釋合同關(guān)鍵指完成6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組，每個(gè)樣品產(chǎn)出不少于6GbClean堿基百分比達(dá)到85%完成轉(zhuǎn)錄本的組裝，獲得Unigene庫(kù)完成Unigene的表達(dá)量分析和差異表達(dá)分析完成CDS預(yù)測(cè)、SSR分析和SNP分析完成Unigene功能注釋和差異表達(dá)功能注釋分析轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程包括樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建及其質(zhì)量控制和上機(jī)。實(shí)驗(yàn)圖1轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程RNA樣品檢完整性等，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組。RNA文庫(kù)構(gòu)用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物用AMPureXPbeads純化cDNA；XPbeads進(jìn)行片段大小選擇；最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)文庫(kù)質(zhì)文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit2.0和Agilent2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大上庫(kù)檢合格后，用HiSeq進(jìn)行高通量，讀長(zhǎng)為PE150對(duì)RawData進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads獲得高質(zhì)量的CleanData。將CleanData進(jìn)行序列組裝，獲得該物種的Unigene庫(kù)?；诖耍梢赃M(jìn)行隨機(jī)性檢驗(yàn)飽和度檢驗(yàn)等文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估合格后進(jìn)行表達(dá)量分析、結(jié)構(gòu)分析并根據(jù)在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)功能注釋和功能富集等分析。無(wú)參考組的轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程見(jiàn)下圖圖2轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控SynthesisSBS高通量平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)序，能夠產(chǎn)出大量的高質(zhì)量Reads，平臺(tái)產(chǎn)RawData以FASTQ格式，每個(gè)樣品的RawData包括兩個(gè)FASTQ文件，F(xiàn)ASTQ格式文件示意圖如下圖3FASTQ堿基質(zhì)量值（QualityScore或Q-score）是堿基識(shí)別（BaseCalling）出錯(cuò)的概率的整數(shù)映射。通常使用的Phred質(zhì)量評(píng)估為：中，P為堿基識(shí)別出錯(cuò)的概率表1PhredQualityProbabilityofIncorrectBaseBaseCall圖4堿基錯(cuò)誤率分布示意注：橫坐標(biāo)為Reads4.1.2堿基含量分的含量每個(gè)循環(huán)上應(yīng)分別相等且整個(gè)過(guò)程穩(wěn)定不變呈水平線由于Reads圖5ATGC注：橫坐標(biāo)為Reads的堿基位置，縱坐標(biāo)為單堿基所占比例去除含有接頭的經(jīng)過(guò)上述一系列的質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量Reads或堿基，稱為CleanData。CleanData同樣以FASTQ格式提供。圖6注：Adapterrelated：過(guò)濾掉的含有接頭Reads數(shù)占總RawReads數(shù)的比例Lowquality：過(guò)濾掉的低質(zhì)量數(shù)占總RawReads數(shù)的比例。CleanReads：經(jīng)過(guò)以上過(guò)濾得到的CleanReads數(shù)占總RawReads該項(xiàng)目各樣品CleanData表2ReadBaseGC123456Reads總數(shù)；BaseNumber：CleanData總堿基數(shù)；GCContent：CleanDataGC含量，即CleanData中G和C兩種堿基占總堿基的百分比；%≥Q30：CleanData質(zhì)量值大于或等于30的堿基所占的百分比。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組延伸成較長(zhǎng)的片段（Contig），并利用這些片段之間的，得到片段集Trinity軟件具體組裝過(guò)程選擇頻率最高的K-mer作為向兩端進(jìn)行貪婪延伸（以K-1個(gè)堿基的對(duì)每個(gè)Component中的Contig構(gòu)建DeBruijn圖對(duì)(4)中得到的DeBruijn圖進(jìn)行簡(jiǎn)化（合并節(jié)點(diǎn)，修剪邊沿以真實(shí)的Read來(lái)解開(kāi)DeBruijn圖，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。圖7Trinity圖8Unigene表3LengthGroup1Group2All1000-TotalTotalN50Mean組裝得到的Unigene的總長(zhǎng)度；N50Length：表示Unigene的N50的長(zhǎng)度；MeanLength：表示Unigene的平均長(zhǎng)度將各樣品的CleanData與組裝得到的Transcript或Unigene庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。比對(duì)到Transcript或Unigene的Reads稱為MappedReads，Mapped表4數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果的比對(duì)統(tǒng)計(jì)CleanMappedMapped注：BMK-ID：百邁客對(duì)樣品的統(tǒng)一編號(hào)；CleanReads：CleanReads數(shù)目，以雙端計(jì)；MappedReads：MappedReads數(shù)目，以雙端計(jì)；MappedRatio：MappedReads在CleanReads中所占的比例。轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量評(píng)通過(guò)插入片段的長(zhǎng)度分布，評(píng)估插入片段長(zhǎng)度的離散程度通過(guò)繪制飽和度圖，評(píng)估文庫(kù)容量和MappedData是否充足mRN段化隨機(jī)性檢通過(guò)MappedReads在各mRNA轉(zhuǎn)錄本上的位置分布，模擬mRN段化結(jié)果，分布可了解mRNA的降解情況。樣品MappedReads在mRNA轉(zhuǎn)錄本上的位置分布示圖9MappedReads在mRNA注：橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)化后的mRNA位置，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)位置區(qū)間內(nèi)Reads在總MappedReads中所占百分比。由于Reads數(shù)目及所占的比例，圖中反映的是所有mRNA各個(gè)區(qū)間內(nèi)的MappedReads比例的匯總。插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)插入片段長(zhǎng)度的離散程度能直接反映出文庫(kù)過(guò)程中磁珠圖10轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)飽和度檢為了評(píng)估數(shù)據(jù)是否充足并滿足后續(xù)分析對(duì)得到的數(shù)進(jìn)行飽和度檢測(cè)。由于一個(gè)物種的數(shù)目是有限的，且轉(zhuǎn)錄具有時(shí)間和空間特異性，因此隨著量的增加，檢測(cè)到的數(shù)目會(huì)趨于飽和。對(duì)于表達(dá)量越高的，越容易被檢測(cè)定量。因此，對(duì)于表達(dá)量越低的，需要更大的數(shù)據(jù)量才能被準(zhǔn)確定量。使用各樣品的MappedData對(duì)檢測(cè)到的不同表達(dá)情況的數(shù)目飽和情況進(jìn)行圖11轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)飽和度模擬示意Unigene功能注InformationResource）PRF（ProteinResearchFoundation）PDB（ProteinDataBank）COG（ClustersofOrthologousGroups）數(shù)據(jù)庫(kù)是對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行同源分類的數(shù)KOG（euKaryoticOrthologousGroups）數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)真核生物，基于直系同Pfam（Proteinfamily）數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)蛋白序列的比對(duì)建立了每個(gè)的氨基酸序套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來(lái)全面描述生物體 產(chǎn)物的功能屬性。該數(shù)庫(kù)總共有三大類，分別是分子功能（MolecularFunction）、細(xì)胞組分（CellularReceptorBinding”或者“SignalTransduction”，同時(shí)有一個(gè)唯一的編號(hào)，形如和生化系統(tǒng)等方面的數(shù)據(jù)，包括代謝通路（PATHWAY）、藥物（DRUG）、疾以上所有數(shù)據(jù)庫(kù)的地址等信息詳見(jiàn)附表本項(xiàng)目通過(guò)選擇BLAST參數(shù)E-value不大于10-5和HMMER參數(shù)E-value不大于10，最終獲得114,651個(gè)有注釋信息的Unigene表5UnigeneAnnotatedSwiss-注：Annotateddatabases：表示各功能數(shù)據(jù)庫(kù)；Unigene：表示注釋到該數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene數(shù)；≥300nt：表示注釋4.5結(jié)構(gòu)分TransDecoder軟件基于開(kāi)放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF）長(zhǎng)度、對(duì)數(shù)似SequenceCDS是Trinity和Cuffinks等軟件推薦的CDS預(yù)測(cè)軟件。圖11CDS注：文件為標(biāo)準(zhǔn)的FASTA格式，每個(gè)序列單元以“>”開(kāi)始到下一個(gè)“>”之前結(jié)束?！?gt;”后面緊接編碼區(qū)序列編MISA（MIcroSAliteidentificationtool）是一款鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SimpleSequenceRepeat，SSR）的軟件，它可以通過(guò)對(duì)Unigene序列的分析，鑒定出6種類型的SSR：?jiǎn)螇A基（Mono-nucleotide）重復(fù)SSR、雙堿基（Di-nucleotide）重復(fù)SSR、nucleotidenucleotide利用MISA軟件對(duì)篩選得到的1kb以上的Unigene做SSR分析，結(jié)果示意如下表6SSRSearchingTotalnumberofsequencesTotalsizeofexaminedsequencesTotalnumberofidentifiedNumberofSSRcontainingNumberofsequencescontainingmorethan1NumberofSSRspresentincompoundMonoDiTriTetraPenta2注：Totalnumberofsequencesexamined：評(píng)估的序列數(shù)目；Totalsizeofexaminedsequencesbp)：評(píng)估的序列總堿基數(shù)目；TotalnumberofidentifiedSSRs：識(shí)別的SSR總數(shù)；NumberofSSRcontainingsequences：包含SSR的序列數(shù)目；Numberofsequencescontainingmorethan1SSR：包含1個(gè)以上SSR的序列數(shù)目；NumberofSSRspresentincompoundformation：以復(fù)合物形式存在的SSR數(shù)目；Mononucleotide：?jiǎn)螇A基重復(fù)SSR；Dinucleotide：重復(fù)SSR；Hexanucleotide：六堿基重復(fù)SSR。對(duì)不同類型的SSR進(jìn)行密度分布統(tǒng)計(jì)，結(jié)果示意圖如下圖12SSR注：橫坐標(biāo)為SSR類型；縱坐標(biāo)為每Mb序列中對(duì)應(yīng)類型的SSR數(shù)目SNP分多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）位點(diǎn)。進(jìn)而可以分析這些SNP位點(diǎn)35bp范圍內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的單堿基錯(cuò)配不超過(guò)3個(gè)經(jīng)過(guò)序列深度標(biāo)準(zhǔn)化的SNP質(zhì)量值大于2.0按照以上條件篩選，樣品T01部分SNP位點(diǎn)信息示意見(jiàn)下表表7SNPAGAGTGGTGCTC7CTCAGAGAGACA表8SNP注：Samples：樣品編號(hào)；HomoSNP：純合型SNP數(shù)目；HeteSNP：雜合型SNP數(shù)目；AllSNP：純合型和雜合SNP總數(shù)目4.6表達(dá)量分采用BLAT[13]將各樣品得到的Reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果FPKM[14]（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionmappedreads）是每百萬(wàn)Reads中來(lái)自比對(duì)到某一每千堿基長(zhǎng)度的Reads數(shù)目，是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中常用的表達(dá)水平估算方法。FPKM能消除長(zhǎng)度和量差異對(duì)計(jì)算表達(dá)的影響，計(jì)算得到的表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的表達(dá)差異。FPKM計(jì)算如下：cDAFragmntsReads數(shù)目；MappedFragments(Million)表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)，以106為單位；Transcriptength(kb)103個(gè)堿基為單位。對(duì)每個(gè)的信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，樣品T01結(jié)果文件示意見(jiàn)下表表9表達(dá)量結(jié)果文件示意000000110000990871：Reads在Unigene上的覆蓋度；FPKM：FPKM方法標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)豐度值；TotalReads：比對(duì)到：上的Reads數(shù)目；UniqReads：比對(duì)到Unigene唯一位置上的Reads數(shù)目；MultiReads：比對(duì)到多個(gè)或一個(gè)Unigene多個(gè)位置上的Reads數(shù)目差異表達(dá)分達(dá)水平存在顯著差異的，稱之為差異表達(dá)（DifferentiallyExpressedGene，DEG）。同樣地，表達(dá)水平存在顯著差異的轉(zhuǎn)錄本，稱之為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本或差異表達(dá)的過(guò)程叫做差異表達(dá)分析（DifferentialExpressionysis）。研究表明，的表達(dá)在不同的間存在生物學(xué)可變性[16][17]（Biological于兩個(gè)條件（即兩組樣品）之間的差異表達(dá)集，A表達(dá)含有多個(gè)重復(fù)樣之為下調(diào)。因此，上調(diào)和下調(diào)是相對(duì)的，由所給A和B的順序決定，若更換A將相關(guān)系數(shù)r（Pearson’sCorrelationCoefficient）作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性對(duì)同一條件的每一對(duì)生物學(xué)重復(fù)樣品的表達(dá)量做相關(guān)性散點(diǎn)圖，樣品T01圖13兩樣品的表達(dá)量散點(diǎn)示意差異表達(dá)篩檢測(cè)差異表達(dá)時(shí)，需要根據(jù)實(shí)際情況選取合適的差異表達(dá)分析軟件。對(duì)于之間的差異表達(dá)集；對(duì)于沒(méi)有生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，則使用EBSeq[21]進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得兩個(gè)樣品之間的差異表達(dá)集。在差異表達(dá)分析過(guò)程中采用了公認(rèn)有效的Benjamini-Hochberg方法對(duì)原有假設(shè)DiscoveryRate）作為差異表達(dá)篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，以降低對(duì)大量的表達(dá)值表10----系，以便快速查看在兩組樣品間的表達(dá)水平差異程度及其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖14差異表達(dá)火山示意通過(guò)MA圖可以直觀地查看兩組樣品中的表達(dá)豐度和差異倍數(shù)的整體分布。圖15差異表達(dá)MA示意差異表達(dá)功能注釋和富集分表11注釋的差異表達(dá)數(shù)量部分統(tǒng)計(jì)DEGSwiss-注：DEGSet：差異表差異表達(dá)GO功能富GO數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)建立了及其產(chǎn)物功能的標(biāo)差異表達(dá)以及所有在GO二級(jí)節(jié)點(diǎn)的注釋結(jié)果見(jiàn)下圖圖16差異表達(dá)GO二級(jí)節(jié)點(diǎn)注釋統(tǒng)計(jì)示意從上圖可以看出差異表達(dá)和所有在GO各二級(jí)功能中的注釋情況其中然后，利用topGO軟件對(duì)注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的樣品組間差異表達(dá)進(jìn)行富集分在有向無(wú)環(huán)圖中，箭頭代表包含關(guān)系，即該節(jié)點(diǎn)的所有同樣注釋到其上級(jí)節(jié)點(diǎn)差異表達(dá)利用topGO進(jìn)行功能富集的分子功能的有向無(wú)環(huán)圖如下圖圖17差異表達(dá)topGO富集有向無(wú)環(huán)示意圖（分子功能差異表達(dá)利用topGO進(jìn)行功能富集的結(jié)果示意如下表 2-alkenal e non-membranespanning 3 ubiquitin-protein proteintyrosinekinase calmodulin-dependent 6 glucanendo-1,3-beta- transferase proteinkinase tyrosinekinaseactivitykinaseactivityglucosidaseactivity差異表達(dá)COG分COG（ClusterofOrthologousGroupsofproteins）數(shù)據(jù)庫(kù)是基于細(xì)菌、藻類、真差異表達(dá)COG分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)下圖圖18差異表達(dá)COG注釋分類統(tǒng)計(jì)示意差異表達(dá)KEGG注在生物體內(nèi)，不同的產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)的Pathway注釋分析有助于進(jìn)一步解讀的功能。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)是關(guān)于Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)。差異表達(dá)的通路注釋結(jié)果見(jiàn)下圖圖19差異表達(dá)的KEGG通路注釋圖示意對(duì)差異表達(dá)KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，分類圖如圖20差異表達(dá)KEGG分類示意注：縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的總數(shù)的差異表達(dá)KEGG通路富集分分析差異表達(dá)在某一通是否過(guò)出現(xiàn)（over-presentation）即為差異表達(dá)的Pathway富集分析。利用富集因子（EnrientFactor）分析Pathway的富集程度，并利用Fisher精確檢驗(yàn)方法計(jì)算富集顯著性。其中富集因子的計(jì)算如下：差異表達(dá)的KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)下圖圖21差異表達(dá)KEGG通路富集散點(diǎn)示意注：圖中每一個(gè)圖形表示一個(gè)KEGG通路，通路名稱見(jiàn)右側(cè)圖例。橫坐標(biāo)為富集因子（EnrientFactor），表異表達(dá)在該通路中的富集水平越顯著?？v坐標(biāo)為log10(Qvalue)，其中Qvalue為多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P差異表達(dá)KEGG的富集分析部分結(jié)果見(jiàn)下表表13差異表達(dá)的KEGG富集部分結(jié)果示Aminoacyl-tRNAGlucosinolateValine,leucineandisoleucineRNASynthesisanddegradationofketoneRibosomebiogenesisinNicotinateandnicotinamide用戶登錄及數(shù) ，，一個(gè)FTP客戶端好之后直接解壓縮然后雙擊文件夾中的圖標(biāo)打開(kāi) .cn，輸入用戶名xxxxxxxxxxxxxx，然，，結(jié)果文件查看說(shuō)上傳中有說(shuō)明文檔readme.txt，詳細(xì)介紹了每個(gè)文件所代表的內(nèi)容。上傳的SVG文件格式的查【參GrabherrMG,HaasBJ,YassourM,,etal.FulllengthtranscriptomeassemblyfromRNASeqdatawithoutareferencegenome.NatureBiotechnology.2011.(29):644-652AltschulSF,MaddenTL,Sch?fferAA,etal.GappedBLASTandPSIBLAST:ANewGenerationofProteinDatabaseSearchPrograms.NucleicAcidsResearch.1997.25(17):3389-3402.DengYY,LiJQ,WuSF,etal.IntegratednrDatabaseinProteinAnnotationSystemandItsLocalization.ComputerEngineering.2006.32(5):71-74ApR,BairochA,WuCH,etal.UniProt:theUniversalProteinknowledgebase.NucleicAcidsResearch.2004.32(Databaseissue):D115-9.AshburnerM,BallCA,BlakeJA,etal.Geneontology:toolfortheunificationofbiology.Naturegenetics.2000.25(1):25-29.TatusovRL,GalperinMY,NataleDA.TheCOGdatabase:atoolforgenomescaleysisofproteinfunctionsandevolution.NucleicAcidsResearch.2000.28(1):33-36.KooninEV,FedorovaND,JacksonJD,etal.Acomprehensiveevolutionaryclassificationofproteinsencodedincompleteeukaryoticgenomes.GenomeBiology,2004,5(2):R7.KanehisaM,GotoS,KawashimaS,etal.TheKEGGresourcefordecipheringthegenome.NucleicAcidsResearch.2004.32(Databaseissue):D277-D280.EddyS.R.ProfilehiddenMarkovmodels(1998)Bioinformatics,14(9),pp.755-FinnRD,BatemanA,ClementsJ,etal.Pfam:theproteinfamiliesdatabase.NucleicAcidsResearch,2013:gkt1223.DobinA,DavisCA,SchlesingerF,etal.STAR:ultrafastuniversalRNA-seqBioinformatics,2013,29(1):15-McKennaA,HannaM,BanksE,etal.TheGenomeysisToolkit:aMapReduceframeworkforyzingnext-generationDNAsequencingdata[J].GenomeResearch.2010,20(9):1297-KentWJ.BLAT-theBLAST-likealignmenttool.GenomeResearch.2002Apr;12(4):656-TrapnellC,WilliamsBA,PerteaG,MortazaviA,etal.TranscriptassemblyandficationbyRNASeqrevealsunannotatedtranscriptsandisoformswitchingduringcelldifferentiation.NatureBiotechnology2010,28(5):511515.Djebali,SarahandMortazavi,etal.Landscapeoftranscriptioninhumancells.Nature2012,489(7414).pp.101-108.ISSN0028-0836.ElowitzMB,LevineAJ,SiggiaED,SwainPS.Stochasticgeneexpressioninasinglecell.2002;297:1183-KasperD.Hansen,ZhijinWu,etal.Sequencingtechnol