共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介及免疫熒光染色

共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介及免疫熒光染色德國(guó)Leica激光掃描共聚焦顯微鏡SP5II簡(jiǎn)介22020/11/30基本參數(shù)型號(hào)：德國(guó)LeicaSP5II激光器：4個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)400nm-800nm物鏡：10倍20倍63倍通道：多通道多色系統(tǒng)：windows7＋LASAF

活體細(xì)胞裝置：配有32020/11/30激光掃描共聚焦顯微鏡的基本特點(diǎn)觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè)，數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察42020/11/30基本功能多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集光學(xué)顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：52020/11/30基本功能定位、定量分析62020/11/30基本功能無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”三維重構(gòu)成像72020/11/30三維重構(gòu)成像82020/11/30基本功能活體細(xì)胞熒光染色的動(dòng)態(tài)觀察及快速掃描成像92020/11/30102020/11/30LASAF軟件的基本界面

112020/11/30在生物醫(yī)學(xué)中的主要應(yīng)用（一）原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)1.細(xì)胞原位檢測(cè)核酸2.原位檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子3.檢測(cè)細(xì)胞凋亡4.細(xì)胞器觀察及測(cè)定5.觀察細(xì)胞骨架6.檢測(cè)細(xì)胞融合7.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪（二）活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)1.細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化的測(cè)量2.膜電位的測(cè)量3.細(xì)胞內(nèi)PH值的測(cè)定4.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生5.檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過程及其定位122020/11/30日常保養(yǎng)及注意事項(xiàng)按照手冊(cè)正確操作。如有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系Leica工程師，尋求專業(yè)幫助。保證外部電源供應(yīng)穩(wěn)定。由于環(huán)境的變化會(huì)影響各部件的相對(duì)位等，無論工作與否請(qǐng)保持室內(nèi)恒溫，清潔，干燥。室溫22-25攝氏度，相對(duì)濕度80%以下為宜。使用一段時(shí)間后，精密器件可能會(huì)由于環(huán)境等因數(shù)引起偏移，為保證儀器正常使用，請(qǐng)與Leica的專業(yè)工程師聯(lián)系，及時(shí)調(diào)較儀器。使用顯微鏡油鏡后請(qǐng)用無水乙醇清潔鏡頭前部。132020/11/30日常保養(yǎng)及注意事項(xiàng)短時(shí)間的停頓工作時(shí)，無需關(guān)閉系統(tǒng)。只是做一些分析圖片等工作時(shí)，無需打開激光器控制鑰匙，以減少激光器的損耗。請(qǐng)避免使用外界存儲(chǔ)設(shè)備（U盤，移動(dòng)硬盤等），以免電腦受病毒感染。請(qǐng)不要安裝包含殺毒軟件在內(nèi)的任何未經(jīng)軟件生產(chǎn)商授權(quán)和經(jīng)Leica工程師認(rèn)可的軟件。

142020/11/30熒光探針的選擇選擇熒光探針的主要步驟：1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢測(cè)的目標(biāo)；2、確定可供選擇的熒光探針的范圍；3、考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；4、熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況。152020/11/30樣品要求樣品經(jīng)熒光標(biāo)記組織切片在載玻片上，用蓋玻片封片固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在共聚焦專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片162020/11/30樣品要求載玻片厚度應(yīng)在～之間，蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在左右標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)盡量去除非特異性熒光信號(hào)封片劑多用甘油：PBS混合液（9：1)172020/11/30激光共聚焦適用的器皿及要求182020/11/30一、活細(xì)胞直接免疫熒光染色（溶酶體或鈣離子）（1）將A549細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中間的圓形凹槽里；（2）染色前吸除培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS洗2-3次；（3）向培養(yǎng)皿中輕輕滴入Lyso-TrackerRed或Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆蓋凹槽里全部細(xì)胞；（4）37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min；（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；（6）再用800μL的PBS覆蓋凹槽里全部細(xì)胞，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察Ca2+的變化。

192020/11/30二、間接免疫熒光染色（FITC標(biāo)記）（1）收集細(xì)胞收集細(xì)胞爬片，吸取各培養(yǎng)孔上清，PBS沖洗（5min×3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。（2）通透及封閉取出細(xì)胞爬片，貼于載玻片上，用PBS（5min×3）沖洗后，加入0.3%TritonX-100穿透細(xì)胞膜5min，PBS（5min×3），加入2%BSA封閉抗原30min。（3）滴加一抗滴加用PBS稀釋的一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。每次實(shí)驗(yàn)均作空對(duì)照白（PBS代替一抗）和同型對(duì)照（兔/鼠血清或IgG亞型代替一抗）。202020/11/30二、間接免疫熒光染色（FITC標(biāo)記）（4）滴加二抗次日用PBS（5min×3）沖洗后，滴加用PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗，37℃孵育60min（避光）。（5）染核并封片用PBS（5min×3）沖洗后，滴加DAPI染核5min,PBS沖洗（5min×3），滴加抗熒光淬滅封片液。（