微生物教程yyd微生物的生長及其控制

微生物教程yyd微生物的生長及其控制第1頁/共48頁第七章微生物的生長及其控制第2頁/共48頁對微生物個體而言，體積的增大叫生長，數(shù)量的增多叫繁殖；對微生物群體而言，生長、繁殖為個體生長、繁殖的總和。霉菌細(xì)胞數(shù)目的增加不伴隨著個體數(shù)目的增加，只能叫生長不叫繁殖。第3頁/共48頁第一節(jié)測定生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要因素第四節(jié)有害微生物的控制第4頁/共48頁第一節(jié)測定生長繁殖的方法一、測生長量。（適合于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)）（一）直接法:測體積：離心沉降，得“菌泥”，即可稱干重：離心后將“菌泥”烘干即可（二）間接法：比濁法：生理指標(biāo)法：含氮量測定：“凱氏定氮”含碳量測定：方法類似氮的測定其它：磷、DNA、RNA、產(chǎn)氣、耗O2第5頁/共48頁

二、計(jì)繁殖數(shù)（一）直接法：比例計(jì)數(shù)法（不常用）血球計(jì)數(shù)板法：適合于單細(xì)胞的真核微生物，即酵母菌（細(xì)菌不可）細(xì)胞個體大，類似人體細(xì)胞（400×顯微鏡）即可。電子自動計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法（電阻原理）第6頁/共48頁（二）、間接法： 液體稀釋法（培養(yǎng)24～48小時，多個試管，大于95％，不常用）平板菌落計(jì)數(shù)法（很常用）-計(jì)算活菌數(shù)（死菌不長菌落）取一定量的菌懸液放入平皿中，冷凝前加入瓊脂，混合，凝固。注意操作要求。返回目錄第7頁/共48頁第二節(jié)微生物的生長規(guī)律一、細(xì)菌個體生長和同步生長同步培養(yǎng)：設(shè)法使某一群體中的所有個體細(xì)胞盡可能處于同樣細(xì)胞生長和分裂周期中，然后通過分析此群體在各階段的生物化學(xué)特性變化，來間接了解單個細(xì)胞的相應(yīng)變化規(guī)律。第8頁/共48頁

獲得同步生長的方法：（1）環(huán)境條件誘導(dǎo)：此法可改變微生物的代謝，使其同步生長，但由于代謝周期改變，研究意義不大。（2）物理學(xué)方法：在隨機(jī)的群體中，選擇出同步生長的個體。具體有：過濾法：孔徑大小不同的微孔濾器以達(dá)到分開的目的。離心法：不同細(xì)胞培養(yǎng)物，懸浮在不被這種菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，密度梯度離心，不同細(xì)胞分布成不同的細(xì)胞帶。硝酸纖維素濾膜法：無論哪種方法，同步生長僅可維持少量的幾代（4代左右），再往后又變?yōu)榉峭降?。故獲得同步生長的微生物應(yīng)該馬上研究，以免代數(shù)過多。第9頁/共48頁二、典型生長曲線（對數(shù)生長曲線或細(xì)菌生長曲線）是描述單細(xì)胞微生物生長規(guī)律的一條曲線概念：將少量純種單細(xì)胞微生物接種到一定體積的液體培養(yǎng)基中，于適宜的條件（溫度、PH、[O2]、N、C源，營養(yǎng)成份比）培養(yǎng)，定時取樣，測定菌數(shù)，以取樣時間為橫坐標(biāo)，以所對應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，即可得到平面直角坐標(biāo)系內(nèi)很多點(diǎn)，將各點(diǎn)連成一條曲線，即典型生長曲線。第10頁/共48頁5.56.08.58.07.57.06.59.0300515202510穩(wěn)定期菌數(shù)的對數(shù)對數(shù)期遲緩期衰退期總菌數(shù)活菌數(shù)生長曲線小時

分為四期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期第11頁/共48頁（一）延滯期（停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期、延遲期）1、定義：指少量微生物接種到新培養(yǎng)液中后，在開始培養(yǎng)的一段時間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不增加的時期。2、特點(diǎn)：①生長速率為零；②細(xì)胞形態(tài)變大或增長；③細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝活躍，易產(chǎn)誘導(dǎo)酶⑤容易受外環(huán)境影響。第12頁/共48頁3、影響因素：延滯期越短，越利于生產(chǎn)1)、菌種差別：不同菌種的延滯期長短不同。2)、接種齡影響：以對數(shù)期接種齡的種子接種，則子代培養(yǎng)物的延滯期就短，反之，如以延滯期或衰亡期的種子接種，子代培養(yǎng)物的延滯期就長3)、接種量影響：同種微生物在一定范圍內(nèi)，接種量和延滯期的長短顯負(fù)。（成反比）4)、培養(yǎng)基的成分：5)、產(chǎn)生原因：從一個環(huán)境到另一個環(huán)境的適應(yīng)，是微生物生理合成的調(diào)整，產(chǎn)生以前沒有的某種酶，暫時缺乏足夠能量和必須的生長因子，種子老化或未活化，接種時造成的損傷。第13頁/共48頁（二）、對（指）數(shù)期1、定義：微生物細(xì)胞以幾何級數(shù)迅速增加的一段時期。2、特點(diǎn):1)、生長速率最大，代時（細(xì)菌數(shù)量增加一倍所需時間）最短。2)、細(xì)胞均衡生長，體內(nèi)成分均勻。3)、酶系活躍，代謝旺盛。第14頁/共48頁3、影響對數(shù)期增代時間的因素

1)、菌種：不同菌種代時差別大2)、營養(yǎng)成分，越全面，越豐富，則代時越短。3)、營養(yǎng)物質(zhì)含量：指某一種營養(yǎng)物的濃度，區(qū)別于總量。在一定范圍內(nèi)，營養(yǎng)物質(zhì)含量，影響微生物的群體代時；在一定范圍外，其只影響最終的菌濃度總量和產(chǎn)物量,不影響代時；生長代謝因子：凡是在較低濃度即可影響微生物生長速度和菌體產(chǎn)量的物質(zhì)稱生長代謝因子。4)、培養(yǎng)溫度：對微生物的生長速率有明顯的影響，對發(fā)酵實(shí)踐、食品保藏和夏天防范食物變質(zhì)和食物中毒等都有重要參考價值。第15頁/共48頁4、對數(shù)期的實(shí)踐意義：1)、是進(jìn)行基礎(chǔ)研究的好材料2)、是增殖噬菌體的最適宿主菌齡3)、也是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡第16頁/共48頁（三）、穩(wěn)定期定義：即對數(shù)期之后，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰的一段時期。新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生長的動態(tài)平衡之中。特點(diǎn)：1)、生長速率為0（生產(chǎn)和死亡的細(xì)胞數(shù)相等，正負(fù)生長持平）2)、這一時期，菌體內(nèi)開始積累儲藏物3)、具有產(chǎn)生芽孢能力的細(xì)菌開始產(chǎn)生芽孢4)、開始合成次生代謝產(chǎn)物（抗生素、毒素等）第17頁/共48頁穩(wěn)定期到來的原因：1)、養(yǎng)份消耗（特別是生長限制因子的消耗），有害代謝產(chǎn)物的積累2)、營養(yǎng)物質(zhì)比例失調(diào)（特別是C/N比值）及PH值的改變實(shí)踐意義1)、是生產(chǎn)量上獲得菌體及其代謝產(chǎn)物的最佳時期。（秋季）2)、是研究中，確定生長因子維生素和氨基酸生物測定的關(guān)鍵時期。3)、是設(shè)計(jì)和確定連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的前提。（區(qū)別于分批培養(yǎng)）第18頁/共48頁(四)、衰亡期（群體呈負(fù)增長）定義：穩(wěn)定期后，群體中細(xì)胞死亡數(shù)量增多，繁殖數(shù)量減少的一段時間。表現(xiàn)：1)、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小差異較大，（嚴(yán)重的發(fā)生菌體自溶）2)、可產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌，芽胞與菌體分離3)、可產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的，此期產(chǎn)物量很高導(dǎo)致因素：由于微生物大量繁殖而導(dǎo)致環(huán)境條件惡化，分解代謝超過了合成代謝，而導(dǎo)致大量菌體死亡。第19頁/共48頁三、微生物連續(xù)培養(yǎng)（發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行）1、定義：即在微生物生長到對數(shù)期之后，以一定的流速加入新鮮培養(yǎng)基，同時排出過多的培養(yǎng)物，這樣就可以維持較高的代謝產(chǎn)量，此法稱微生物連續(xù)培養(yǎng)。第20頁/共48頁2、根據(jù)控制方式和使用目的分兩類：（1）、恒濁培養(yǎng)：使用設(shè)備－恒濁器此法是通過光電管接受培養(yǎng)器內(nèi)的細(xì)菌濃度變化所引起的光亮度變化而調(diào)整加入反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基的速度，使培養(yǎng)過程維持在較高的生長水平。恒濁培養(yǎng)在實(shí)踐中可獲得大量的菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物。若產(chǎn)物與菌體生長不平行，則此方法不適用。（2）、恒化連續(xù)培養(yǎng)：（適用于科研和理論研究）此法是通過改變培養(yǎng)液內(nèi)某種關(guān)鍵成分（限制性生長因子）來實(shí)現(xiàn)控制微生物的生長速率，使細(xì)菌處于較最高生長率略低的水平。上述兩種連續(xù)培養(yǎng)法均為一級連續(xù)培養(yǎng)。在生產(chǎn)上，有時代謝產(chǎn)物量和菌體量未必成正相關(guān)，故又設(shè)計(jì)出多級連續(xù)培養(yǎng)。第21頁/共48頁連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、高效、簡化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等操作

2、自動化控制，便于電腦操作；

3、產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；

4、節(jié)約動力、人力、水、蒸汽。缺點(diǎn)：（1）菌種變異退化（必然的），故連續(xù)培養(yǎng)時有時間限制。（2）易被雜菌污染。返回目錄第22頁/共48頁第三節(jié)影響微生物生長的主要因素營養(yǎng)條件（第五章）物理?xiàng)l件（溫度，氧氣，PH值）第23頁/共48頁

一、溫度

原因：⑴影響酶的活性，最適酶促反應(yīng)溫度。⑵影響細(xì)胞質(zhì)膜的流動性，溫度越高流動性越大。⑶影響物質(zhì)的溶解度。所有細(xì)菌均有其溫度三基點(diǎn)：最適生長溫度、最高生長溫度、最低生長溫度（常利用其保持食品、菌種）最適生長溫度：某菌分裂代時最短或生長速率最高的培養(yǎng)溫度。對細(xì)菌而言，其適宜的溫度跨度很大，故從溫度角度分為三大類群：第24頁/共48頁適溫菌：大多數(shù)寬溫菌/窄溫菌嗜熱菌：火山口嗜冷菌：北極，冰川第25頁/共48頁

二、氧氣1.專性好氧菌：需在有氧環(huán)境生長繁殖，靠有氧呼吸產(chǎn)生能量。體內(nèi)有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，集中在表面上生長形成菌膜。多數(shù)真菌和很多細(xì)菌均屬此類。2.兼性厭養(yǎng)菌：有無氧氣均可生長，有氧氣時生長的更好，靠呼吸產(chǎn)能；無氧氣時靠發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能。體內(nèi)有SOD和過氧化氫酶。許多酵母和細(xì)菌屬此類。有氧呼吸：底物脫氫，H由外來受氫體接受（如O2）無氧呼吸：底物脫氫，H由除氧外的受氫體接受（如NO3-鹽、SO42-鹽、CO2、Fe3+或有機(jī)物）發(fā)酵：無外源受體（自身內(nèi)部進(jìn)行）故兼性厭養(yǎng)菌在半固體培養(yǎng)基中各處均有，以上部居多。第26頁/共48頁3.微好氧菌：在氧含量較底的條件下，﹝0.01～0.03巴，正常的氧分壓是0.2巴﹞才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終受體而產(chǎn)能的一類菌。4.耐氧菌：可在有氧條件下進(jìn)行發(fā)酵性厭養(yǎng)生活，氧對其無害，體內(nèi)無呼吸鏈，有SOD，有過氧化物酶，缺少過氧化氫酶。在沒有氧的條件下生長。如乳酸菌。5.厭氧菌：（專性厭氧菌或絕對厭氧菌）在有氧條件下不生長，體內(nèi)無SOD，有過氧化物酶，缺少過氧化氫酶。能量只能通過發(fā)酵或無氧呼吸獲得，氧氣對其有毒害作用，在有氧條件下或休眠或死亡。例如：梭狀芽孢桿菌、韋氏梭菌、產(chǎn)甲硫細(xì)菌（沼氣）、雙歧桿菌、在半固體培養(yǎng)基中（加入吸附氧氣的試劑），在底部生長。產(chǎn)生：在生物進(jìn)化的過程中，好氧的菌體內(nèi)產(chǎn)生的三種酶能夠把有氧環(huán)境產(chǎn)生的超氧負(fù)離子、過氧化氫、過氧化物消除。（O2—比H2O2強(qiáng)）第27頁/共48頁

三、PH原因：酶促反應(yīng)的最適PH值適宜的PH在（2～11）對于某種具體菌而言，亦有其PH三基點(diǎn)：（最適PH、最高PH、最低PH）群體按照所適宜的PH分為：嗜堿菌：包括嗜堿菌/耐堿菌嗜酸菌：包括嗜酸菌/耐酸菌多數(shù)菌的適宜PH為中性左右（5～9）細(xì)菌一般喜歡中性環(huán)境PH（7.0～7.2），真菌喜中性偏酸環(huán)境PH（4～6），放線菌喜中性偏堿環(huán)境PH（7.6～8）。第28頁/共48頁嗜酸菌、嗜堿菌、中性菌原生質(zhì)內(nèi)的PH均幾乎為中性，關(guān)鍵在于“周質(zhì)空間”（壁膜空間）的調(diào)節(jié)。但菌經(jīng)代謝會改變外界環(huán)境。培養(yǎng)基內(nèi)中性成分：分為兩大類（有機(jī)物、無機(jī)物）第29頁/共48頁有機(jī)物：糖類脂類

有機(jī)酸

蛋白質(zhì)胺類脫羧

無機(jī)物：

（NH4）2SO4

NaNO3

氨根離子選擇吸收

硝酸根離子選擇吸收

H2SO4

NaOH

變酸

變堿

發(fā)酵，氧化

水解

第30頁/共48頁P(yáng)H調(diào)節(jié)措施：治標(biāo)：過酸：加NaOH、NaCO3

過堿：加H2SO4、HCL治本：過酸：加適當(dāng)N源：尿素、NaNO3、NH4OH、或蛋白質(zhì)；提高透氣性。過堿：加適當(dāng)C源：糖、乳酸、油脂；降低透氣性。第31頁/共48頁

四．輻射和超聲波

輻射是通過空氣或外層空間以波動的方式從一個地方傳播或傳遞到另一個地方的能源。包括離子和電磁波。電磁輻射包括可見光、紅外線、紫外線、x射線、γ射線。波長越長含能量越低，反之則高。無線電波最長，生物學(xué)效應(yīng)最弱。有些可見光是藍(lán)細(xì)菌和藻類進(jìn)行光合作用的主要能源。紫外射線的波長136～400納米有殺菌作用，波長較短（x、α、β、γ）往往可以引起水與其他物質(zhì)的電離。對微生物易起有害作用。故作為一種滅菌措施。第32頁/共48頁一：紫外射線：使被照射物的分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級。波長265～266納米的殺菌力最強(qiáng)。紫外輻射對微生物有明顯的致死作用，是強(qiáng)殺菌劑。紫外穿透能力差。不易透過不透明的物質(zhì)。只適用于空氣和物體表面消毒。紫外輻射對細(xì)胞有害。細(xì)胞很多物質(zhì)可以吸收紫外線。例如，細(xì)胞質(zhì)中的核酸及其堿基對對紫外線的吸收能力特強(qiáng)。吸收峰260納米蛋白質(zhì)的吸收峰為280納米輻射作用引起細(xì)胞代謝機(jī)能的改變而發(fā)生變異?？傊?，紫外線的殺菌作用是復(fù)雜的主要是對DNA的作用。最明顯的是形成胸腺嘧啶二聚體。影響：干細(xì)胞比濕細(xì)胞抗性強(qiáng)，孢子比營養(yǎng)細(xì)胞強(qiáng)，帶色的細(xì)胞能更好的抵抗紫外輻射。光復(fù)活現(xiàn)象。第33頁/共48頁二：電離輻射：（x、α、β、γ）有足夠的能量從分子中逐出電子而使之電離。電離輻射的殺菌作用不是靠輻射對細(xì)胞直接作用，而是間接的通過射線引起環(huán)境中水分子和細(xì)胞中水分子在吸收能量后導(dǎo)致電離所產(chǎn)生的自由基起作用這些游離基團(tuán)能與細(xì)胞中的敏感大分子反應(yīng)并使之失活。一般用于大體積的物品消毒。某些化合物如碘化鉀對電離輻射有保護(hù)作用。超聲波使細(xì)胞破裂。返回目錄第34頁/共48頁

第四節(jié)、有害微生物的控制一、概念：1滅菌：用強(qiáng)烈的理化因素使物體內(nèi)外一切菌永遠(yuǎn)喪失生長繁殖能力的方法。殺菌：菌體雖死，形態(tài)尚存溶菌：菌體殺死后細(xì)胞發(fā)生溶化、消失。2消毒：采用較溫和的理化因素，殺死物體表面或內(nèi)部部分對人體有害的病源菌，被消毒的物體基本保證無害的措施。例如：常用消毒藥劑及物理消毒措施（巴氏消毒法）3防腐：利用某種理化因素完全抑制霉腐菌的生長繁殖，防止食品發(fā)生霉腐的措施。第35頁/共48頁防腐的措施：（1）低溫：休眠狀態(tài)下保存菌種；保存食物、藥品、菌種。（2）缺氧：抽真空、充氮或二氧化碳、多用化學(xué)除氧劑；密閉容器中加入除氧劑有效的防止食品和糧食的霉腐變質(zhì)。（3）干燥：曬干，紅外線、吸濕劑；在密封的條件下，用生石灰，無水氯化鈣，五氧化二磷，氫氧化鉀或硅膠作吸濕劑保藏食品、藥品、器材。第36頁/共48頁（4）高滲：提高細(xì)胞外的滲透壓；鹽腌和糖漬，例如果脯、咸菜等。糖的濃度為50～70％，鹽的濃度為10～15％，由于鹽的分子小并能離解，百分濃度相當(dāng)時鹽的保存效果好于糖。（5）高酸度：泡菜，利用乳酸菌的厭氧發(fā)酵使新鮮的蔬菜產(chǎn)生大量的乳酸，抑制雜菌和霉菌的目的。乳酸菌、醋酸菌。（6）防腐劑：食品、調(diào)味品、飲料、化妝品。第37頁/共48頁4化療：利用具有高度選擇性的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病源菌的生長繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。常見的化學(xué)治療劑：抗生素、磺胺類藥物、中草藥等。例如：黃連、雙黃連；第38頁/共48頁二、物理殺菌的代表：高溫（一）溫度殺菌作用的種類：干熱滅菌、濕熱滅菌蛋白質(zhì)的含水量與其凝固的溫度成反比。濕熱滅菌主要通過熱蒸氣殺死微生物，由于蒸氣的穿透力比熱空氣強(qiáng)而且更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵的結(jié)構(gòu)，因此在同一溫度下濕熱要比干熱效果好。第39頁/共48頁1.干熱滅菌法：（1）火焰灼燒法：此法滅菌徹底，迅捷簡便。但使用范圍有限。常用于接種工具，污染物品及實(shí)驗(yàn)動物尸體等的廢棄物的處理。（2）干熱滅菌器：電熱鼓風(fēng)干燥箱以溫度達(dá)到160℃算起2小時；此法只適用于玻璃器皿，金屬器具等耐熱物品的滅菌。不可以有介質(zhì)，滅培養(yǎng)基中的菌不可用。第40頁/共48頁2.濕熱滅菌法：一般菌的營養(yǎng)體在60℃時5-10分鐘可殺死，酵母真菌的孢子耐熱在80℃以上才能殺死；細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般120℃處置20分鐘才能殺死。主要有以下幾種方法:第41頁/共48頁(1)常壓法:

A.巴氏消毒法：用于牛奶、啤酒、果酒、醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，主要是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），是一種低溫消毒法，具體的處理溫度和時間各不相同，一般在60～85℃下處理15秒至30分鐘。具體方法有兩類，第一類稱為低溫維持法，另一類稱為高溫瞬時法，用于牛奶消毒只要在72℃下保持15秒鐘即可。B.煮沸消毒法：一般用于飲用水、注射器的消毒。（100℃，15分鐘以上，并在水中加入1％碳酸鈉或2～5％石炭酸，效果好。）C.間歇滅菌法：又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。適用不耐熱又需徹底滅菌的材料。方法是將待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)3天，即可在較低的溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。例如，含糖培養(yǎng)基。第42頁/共48頁（2）加壓法（一）常用方法：

A.常規(guī)加壓滅菌法（加壓蒸氣滅菌鍋）：在壓力為1㎏/㎝2或15磅/英寸2條件下達(dá)到沸點(diǎn)121.3℃，維持15～20分鐘，或壓力0.7㎏/㎝2或10磅/英寸2時達(dá)到115℃維持35分鐘。

B.連續(xù)加壓滅菌法（連消法）：適用于大規(guī)模的發(fā)酵工廠中做培養(yǎng)基滅菌。方法：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷的處理5～15秒（135～140℃），再冷卻，重復(fù)循環(huán)，最終進(jìn)入發(fā)酵罐。概念：熱死時間：指在某一溫度下，殺死某些微生物的水懸浮群體所需的最短時間。熱死溫度：熱死點(diǎn)，指在一定的時間內(nèi)（一般為十分鐘）殺死某些微生物的水浮群體所需的最低溫度。第43頁/共48頁(二)影響加壓蒸氣滅菌效果的因素：影響加壓蒸氣滅菌效果的因素：滅菌物體的含菌量高壓鍋內(nèi)冷空氣排除的程度注：做實(shí)驗(yàn)時待噴出的氣體是蒸氣時，才把手動閥關(guān)掉細(xì)菌生長PH值滅菌對象的體積；（影響熱的傳導(dǎo)速率）