微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)一

微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)一第1頁(yè)/共73頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)（一）第2頁(yè)/共73頁(yè)一、顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)第3頁(yè)/共73頁(yè)1.普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)

（lightmicroscopy）結(jié)構(gòu)光學(xué)放大系統(tǒng)：物鏡（油鏡、高倍鏡和低倍鏡）和目鏡（10×、16×）照明系統(tǒng)：光源、反光鏡和聚光器機(jī)械和支架系統(tǒng)第4頁(yè)/共73頁(yè)第5頁(yè)/共73頁(yè)第6頁(yè)/共73頁(yè)第7頁(yè)/共73頁(yè)第8頁(yè)/共73頁(yè)分辨率分辨率：指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。

D=0.61λ/(n·sinθ)D：分辨率

λ：波長(zhǎng)

n：物鏡與物體間介質(zhì)折射率

2θ：物鏡鏡口角

N.A：即n·sinθ，數(shù)值孔徑2θ最大值=140℃，空氣中n=1，最短的可見光波長(zhǎng)λ=450nm，分辨率D=292nm，約0.3um油鏡：n=1.52，D=0.2um普通光鏡的最大分辨率D=0.2um第9頁(yè)/共73頁(yè)第10頁(yè)/共73頁(yè)2.相差顯微鏡技術(shù)

（phase-contrastmicroscopy）相差顯微鏡與普通顯微鏡的區(qū)別：在物鏡后裝有一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會(huì)聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，表現(xiàn)出肉眼可見的明暗區(qū)別。相差顯微鏡將光程差或相位差轉(zhuǎn)換為振幅差，即明暗差別。相差顯微鏡的樣品不需染色，可以觀察活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。光線通過不同密度的物質(zhì)時(shí)，其滯留程度也不同，密度大則光的滯留時(shí)間長(zhǎng)，密度小則滯留時(shí)間短。第11頁(yè)/共73頁(yè)第12頁(yè)/共73頁(yè)3.熒光顯微鏡技術(shù)

(fluorescencemicroscopy)儀器：點(diǎn)光源（高壓汞燈），濾色系統(tǒng)原理：熒光物質(zhì)，激發(fā)光，發(fā)射光利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源（高壓汞燈），以最小表面釋放出最大數(shù)量的紫外光（365nm）和藍(lán)紫光（420nm），經(jīng)過濾色系統(tǒng)，作為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡（石英玻璃制成）的放大進(jìn)行觀察，這種熒光在顯微鏡下很容易辨認(rèn)，敏感性高，能對(duì)細(xì)胞的特定物質(zhì)進(jìn)行定性、定位和定量觀察。熒光：自發(fā)熒光：通過激發(fā)光使物體發(fā)出熒光，如葉綠素、維生素A誘發(fā)熒光：通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)出的熒光，如甲醛蒸汽處理誘發(fā)細(xì)胞和組織中生物單胺類產(chǎn)生熒光熒光染料染色熒光：丫啶橙對(duì)細(xì)胞DNA、RNA同時(shí)染色后，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙色熒光。第13頁(yè)/共73頁(yè)第14頁(yè)/共73頁(yè)第15頁(yè)/共73頁(yè)第16頁(yè)/共73頁(yè)4.電子顯微鏡技術(shù)

（electronmicroscopy）原理：使用波長(zhǎng)比可見光短得多的電子束作為光源（波長(zhǎng)一般小于0.1nm），用電磁透鏡聚焦，電鏡鏡筒中要求高真空，圖象需用熒光屏來顯示或感光膠片作記錄。分辨率：0.2nm；放大倍數(shù)106倍。人眼分辨率0.2mm；光學(xué)顯微鏡分辨率0.2um，放大倍數(shù)1000倍?；緲?gòu)造電子束照明系統(tǒng)：電子槍、聚光鏡成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡、投影鏡真空系統(tǒng)：用兩級(jí)真空泵抽氣，保持電子槍、鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空。記錄系統(tǒng)：用熒光屏顯示或感光膠片作記錄。第17頁(yè)/共73頁(yè)電子顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像系統(tǒng)光學(xué)顯微鏡200nm可見光玻璃透鏡不要求利用樣品對(duì)光的吸收形

(λ:400-700nm)成明暗反差和顏色變化

100nm紫外光玻璃透鏡不要求

(λ約200nm)

電子顯微鏡約0.1nm電子束電磁透鏡1.33×10-5~利用樣品對(duì)電子的散

(λ:0.01~0.9nm)1.33×10-3Pa射和透射形成明暗反差第18頁(yè)/共73頁(yè)第19頁(yè)/共73頁(yè)超薄切片技術(shù)固定--脫水--包埋--切片--染色固定：要求保持樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，常用固定劑為戊二醛和鋨酸等，通常在低溫下固定。包埋：使樣品中各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片過程中都得到均勻良好的支撐，使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強(qiáng)度，并能耐受干燥以及觀察時(shí)的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂。包埋劑多與水不相溶，所以包埋前要經(jīng)過一系列脫水處理。切片：厚度通常為40~50nm，常用玻璃刀。染色：用重金屬鹽進(jìn)行染色以形成明暗反差。樣品中不同成分對(duì)染料有不同親和性（脂肪：鋨酸；蛋白質(zhì)：鉛鹽；核酸：醋酸鈾）第20頁(yè)/共73頁(yè)第21頁(yè)/共73頁(yè)第22頁(yè)/共73頁(yè)第23頁(yè)/共73頁(yè)第24頁(yè)/共73頁(yè)冷凍蝕刻技術(shù)方法冷凍—快速低溫冷凍法將樣品在液氮或液氦中迅速冷凍斷裂—低溫下斷裂蝕刻：在真空中冰升華復(fù)型用鉑、金等金屬進(jìn)行傾斜噴鍍，以形成對(duì)應(yīng)于凹凸的電子反差，再經(jīng)碳垂直于斷面進(jìn)行真空噴鍍，形成一個(gè)連續(xù)的碳膜，然后用消化液把樣品本身消化掉，將剩下的碳膜及其構(gòu)成圖形的金屬微粒移到載網(wǎng)上進(jìn)行電鏡觀察。冷凍蝕刻技術(shù)主要用來觀察斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)，樣品不需包埋、固定，能更好地保持樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu)。第25頁(yè)/共73頁(yè)第26頁(yè)/共73頁(yè)第27頁(yè)/共73頁(yè)第28頁(yè)/共73頁(yè)第29頁(yè)/共73頁(yè)第30頁(yè)/共73頁(yè)第31頁(yè)/共73頁(yè)負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色：利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈉等）將生物標(biāo)本包圍起來，增強(qiáng)背景散射電子的能力以提高反差，在暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu)。主要用于顆粒狀標(biāo)本（細(xì)菌、病毒、分離的細(xì)胞器等）的研究。第32頁(yè)/共73頁(yè)第33頁(yè)/共73頁(yè)二、常用的微生物染色法簡(jiǎn)單染色法革蘭氏染色法負(fù)染色法第34頁(yè)/共73頁(yè)細(xì)菌的觀察方法水浸片（壓滴法）：在載玻片中央滴一滴無菌水，再在其中加入少許菌體，使其均勻分布在無菌水中，蓋上蓋玻片，鏡檢。懸滴法：把要觀察的含菌液體，滴在蓋玻片上，然后把它翻過來，放置在凹孔載玻片上，使液滴懸掛在凹孔室內(nèi)。染色法：觀察細(xì)胞細(xì)致形態(tài)和主要構(gòu)造。第35頁(yè)/共73頁(yè)1.簡(jiǎn)單染色法簡(jiǎn)單染色法：只用一種染料處理菌體，適用于一般觀察。涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢第36頁(yè)/共73頁(yè)革蘭氏染色法革蘭氏染色法：由丹麥醫(yī)生C.Gram于1884年創(chuàng)立，其基本操作分為初染、媒染、脫色和復(fù)染四個(gè)步驟。甲菌G+

初染媒染

脫色復(fù)染結(jié)晶紫碘液乙醇沙黃乙菌G-

第37頁(yè)/共73頁(yè)革蘭氏染色法的原理通過初染和媒染后，在細(xì)菌細(xì)胞的膜或原生體上染上了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的大分子復(fù)合物。G+細(xì)菌由于細(xì)胞壁較厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，在用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔因脫水而明顯收縮，又由于其基本不含類脂，故在用乙醇處理時(shí)不會(huì)在壁上溶出縫隙，因此結(jié)晶紫與碘復(fù)合物仍牢牢阻留在其細(xì)胞壁內(nèi)，呈紫色；G-細(xì)菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交聯(lián)松散，用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔不易收縮，加上其類脂含量高，乙醇把類脂溶解，在細(xì)胞壁上出現(xiàn)較大縫隙，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物極易被溶出細(xì)胞壁，因此通過乙醇脫色后，細(xì)胞呈無色，再經(jīng)沙黃等染料復(fù)染后呈紅色。第38頁(yè)/共73頁(yè)第39頁(yè)/共73頁(yè)第40頁(yè)/共73頁(yè)第41頁(yè)/共73頁(yè)負(fù)染色法負(fù)染色法（莢膜染色法）：用有色背景襯托無色莢膜。第42頁(yè)/共73頁(yè)三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基：一種人工配制的、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合養(yǎng)料。因此任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需的六大營(yíng)養(yǎng)要素，且其間的比例是合適的。選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的四個(gè)原則：目的明確營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)

C/N比=C源中C原子摩爾數(shù)/N源中N原子摩爾數(shù)經(jīng)濟(jì)節(jié)約以粗代精，以“野”代“家”，以廢代好，以簡(jiǎn)代繁，以烴代糧，以纖代糖，以氮代朊，以“國(guó)”代“進(jìn)”物理化學(xué)條件適宜：pH、滲透壓、水活度選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的四個(gè)方法：生態(tài)模擬、查閱文獻(xiàn)、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較第43頁(yè)/共73頁(yè)目的明確培養(yǎng)對(duì)象：四大類微生物所需C源、N源、C/N比、生長(zhǎng)因子、pH、滲透壓都不同。用途實(shí)驗(yàn)室研究：不必過多地計(jì)較其成本一般培養(yǎng)用：天然培養(yǎng)基遺傳代謝或生理研究：合成培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)種子培養(yǎng)基：N源豐富（C/N比低）生產(chǎn)代謝產(chǎn)物含碳的代謝產(chǎn)物：碳源豐富含氮的代謝產(chǎn)物：氮源豐富加入特定元素、特定前體物質(zhì)第44頁(yè)/共73頁(yè)pH微生物生長(zhǎng)的最適pH值不同。細(xì)菌：pH7.0~8.0，放線菌：pH7.5~8.5，酵母菌：

pH3.8~6.0，霉菌：pH4.0~5.8微生物生長(zhǎng)代謝過程中，會(huì)引起培養(yǎng)基pH的變化。糖類發(fā)酵、氧化有機(jī)酸有機(jī)物脂肪水解有機(jī)酸培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)脫羧胺類中性成分(NH4)2SO4NH4+選擇吸收H2SO4

無機(jī)鹽

NaNO3NO3-選擇吸收NaOH

加磷酸緩沖液內(nèi)源調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)加CaCO3或NaHCO3

外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要流加酸液或堿液*：培養(yǎng)基配好后，先用稀酸或稀堿（10%）調(diào)pH.第45頁(yè)/共73頁(yè)滲透壓（Osmoticpressure）滲透壓：由于溶質(zhì)濃度差而在細(xì)胞膜兩側(cè)造成的壓力差。滲透壓的大小與溶液中分子或離子的質(zhì)點(diǎn)數(shù)有關(guān)。等重的物質(zhì)，其分子或離子越小，則質(zhì)點(diǎn)數(shù)越多，滲透壓越大。低滲溶液：外界濃度低，細(xì)胞吸水膨脹。等滲溶液：適宜微生物生長(zhǎng)。高滲溶液：外界濃度高，細(xì)胞失水，發(fā)生質(zhì)壁分離。第46頁(yè)/共73頁(yè)水活度aw水活度aw：表示在天然環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量。自由水：微生物可利用。 細(xì)胞內(nèi)水分狀態(tài)結(jié)合水：微生物不能利用。

aw定量：在相同溫度和壓力下，某溶液的蒸汽壓P與純水蒸汽壓P0之比，也等于溶液的百分相對(duì)濕度。

aw=P/P0=ERH/100

純水：aw=1，無水：aw=0，∴0<aw<1

各種微生物生長(zhǎng)繁殖的aw值范圍：0.998~0.6第47頁(yè)/共73頁(yè)培養(yǎng)基的種類根據(jù)培養(yǎng)基的成分分：天然培養(yǎng)基（complexmedium或undefinedmedium）：利用動(dòng)植物或微生物或其提取物制成的培養(yǎng)基，人們無法確切知道其中的成分。如：培養(yǎng)細(xì)菌的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基、培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基。組合培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基）（definedmedium）：一類用多種高純化學(xué)試劑配制成的、各成分的量都確切知道的培養(yǎng)基。如：培養(yǎng)放線菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基、培養(yǎng)霉菌的察氏培養(yǎng)基。半組合培養(yǎng)基（semi-definedmedium）：既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。如：培養(yǎng)真菌的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基第48頁(yè)/共73頁(yè)根據(jù)培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)分：液體培養(yǎng)基（liquidmedium）半固體培養(yǎng)基（semi-solidmedium）：液體培養(yǎng)基+0.2~0.5%瓊脂固體培養(yǎng)基（solidmedium）：凝固培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+1.5~2%瓊脂（5~12%明膠）非可逆性凝固培養(yǎng)基：用血清或硅膠作凝固劑天然固體培養(yǎng)基：用麩皮、米糠、木屑等配制而成。第49頁(yè)/共73頁(yè)根據(jù)培養(yǎng)基功能分：選擇性培養(yǎng)基（selectedmedium）：根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，其功能是使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌，從而提高該菌的篩選效率。方法：投其所好，取其所抗。鑒別性培養(yǎng)基（differentialmedium）：培養(yǎng)基中加有能與某一菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而用肉眼就能使該菌菌落與外形相似的它種菌落相區(qū)分的培養(yǎng)基。如：伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）——鑒別腸道菌。第50頁(yè)/共73頁(yè)第51頁(yè)/共73頁(yè)滅菌與消毒滅菌：采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物（包括病原微生物和非病原微生物）永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施。消毒：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被消毒的物體基本無害的措施。如：巴氏消毒法防腐：利用某種理化因素（低溫、缺氧、干燥、高滲、高酸度、防腐劑）完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。第52頁(yè)/共73頁(yè)干熱滅菌法原理：高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生變性、破壞。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。在濕熱條件下，菌體吸收水分，蛋白質(zhì)易凝固；濕熱的穿透力比干熱大；濕熱的蒸汽有潛熱存在。1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出2.26KJ的熱量。第53頁(yè)/共73頁(yè)火焰灼燒法：直接在火焰上灼燒滅菌。適用范圍：接種針（環(huán)），試管口，三角瓶口，金屬小工具。第54頁(yè)/共73頁(yè)烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法：160℃2h，適用于耐高溫器皿。注意：溫度不可超過180℃，超過180℃，玻璃器皿上的棉塞及外面包的紙張均會(huì)被烤焦著火。由于熱空氣穿透力弱，滅菌時(shí)物品不宜堆放得太緊。降溫要緩慢，以免玻璃破裂，待溫度＜60℃時(shí)，方可打開箱門。第55頁(yè)/共73頁(yè)濕熱滅菌法煮沸消毒法：一般用于飲用水的消毒，100℃15min以上。間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基。

80~100℃15~60min室溫或37℃過夜巴氏消毒法（Pasteurization）高壓蒸汽滅菌法（Autoclave）重復(fù)三次培養(yǎng)基徹底滅菌第56頁(yè)/共73頁(yè)巴氏消毒法（Pasteurization）目的：殺死無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），不影響食品風(fēng)味。方式低溫維持法（LTH）：63-66oC,30min高溫瞬時(shí)法（HTST）：72oC,15sec用途：用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法。第57頁(yè)/共73頁(yè)高壓蒸汽滅菌法（Autoclave）儀器：高壓蒸汽滅菌鍋1.05kg/cm2或15磅/英寸2，即121oC，15-20min注意事項(xiàng)：滅菌前應(yīng)先排盡鍋內(nèi)空氣第58頁(yè)/共73頁(yè)第59頁(yè)/共73頁(yè)第60頁(yè)/共73頁(yè)影響加壓蒸汽滅菌的因素滅菌物體的含菌量：含菌量↑，滅菌時(shí)間↑滅菌對(duì)象的pH：pH<6，微生物易死亡；pH6.0~8.0，微生物不易死亡滅菌對(duì)象的體積：影響熱傳導(dǎo)率加熱與散熱速度滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響：加壓蒸汽滅菌不是靠蒸汽壓力，而是靠蒸汽溫度，滅菌時(shí)要先排盡鍋內(nèi)空氣，否則壓力表上壓力=鍋內(nèi)水蒸汽壓力+空氣壓力↓↓壓力表上溫度鍋內(nèi)溫度第61頁(yè)/共73頁(yè)滅菌物體含菌量的影響芽孢數(shù)目和滅菌時(shí)間的關(guān)系芽孢數(shù)/ml在100℃下殺菌時(shí)間（分）

10000000019750000001650000000142500000012100000081000006第62頁(yè)/共73頁(yè)pH對(duì)滅菌時(shí)間的影響

溫度芽孢數(shù)滅菌時(shí)間（分）（℃）（個(gè)/ml）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150第63頁(yè)/共73頁(yè)滅菌對(duì)象體積的影響不同容量的液體的滅菌時(shí)間容器（ml）在121~123℃下所需滅菌時(shí)間（分）三角燒瓶

5012~1420012~1550017~22100020~25200030~35血清瓶

900050~55第64頁(yè)/共73頁(yè)空氣排除度對(duì)滅菌溫度的影響

壓力表讀數(shù)鍋內(nèi)溫度（℃）

kg/cm2磅/英寸2純蒸汽排除1/2空氣不排除空氣

0.35510994720.7010115105901.05151211121001.40201261181091.75251301241152.1030134128121第65頁(yè)/共73頁(yè)高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的影響形成沉淀物牛肉膏、蛋白胨、麥芽汁等天然培養(yǎng)基滅菌后，發(fā)生沉淀。（一般不影響微生物生長(zhǎng)）培養(yǎng)基中含Ca、Mg、Fe、Zn等離子，加熱后易形成磷酸鹽、碳酸鹽沉淀。破壞營(yíng)養(yǎng)，提高色澤褐變：含糖較高的培養(yǎng)基滅菌后，顏色發(fā)生變化，如黃、褐色，一般顏色越深，發(fā)酵效果越差。原因：還原糖的羰基與氨基酸或蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)→氨基糖（褐色）；部份糖分解→焦糖改變培養(yǎng)基pH：滅菌后，培養(yǎng)基pH下降0.2~0.3降低培養(yǎng)基濃度：氣溫低時(shí)會(huì)增加冷凝水第66頁(yè)/共73頁(yè)滅菌溫度和時(shí)間對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分破壞的影響滅菌溫度（℃）滅菌時(shí)間（分）營(yíng)養(yǎng)成分的破壞（%）

10040099.3110306711515501204271300.