基因突變重組與檢測(cè)技術(shù)

基因突變重組與檢測(cè)技術(shù)第1頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容介紹二、基因重組技術(shù)三、基因突變的檢測(cè)方法1.分子雜交技術(shù)3.高通量基因測(cè)序技術(shù)一、基因突變的產(chǎn)生與后果2.基因測(cè)序技術(shù)第2頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四遺傳中心法則回顧轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制第3頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)基因突變的產(chǎn)生與后果點(diǎn)突變基因缺失插入基因異位或重排表觀遺傳學(xué)基因突變的種類第4頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的替換、增添和缺失，而引起的基因序列的改變一、基因突變的定義┯┯┯┯

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┷┷┷┷增添缺失替換第5頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因突變的原因和類型外界因素物理因素化學(xué)因素生物因素內(nèi)部因素DNA修復(fù)功能減弱類型原因自然突變?nèi)斯ふT變第6頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因突變的特點(diǎn)和意義意義：新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進(jìn)化的途徑。特點(diǎn)普遍性:生物界中普遍存在隨機(jī)性:可發(fā)生在生物個(gè)體發(fā)育任何時(shí)期不定向性：突變無明顯偏倚低頻性:自然狀態(tài)下突變頻率很低10－5-10-8多害少利性：多數(shù)有害,少數(shù)有利第7頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四點(diǎn)突變的實(shí)例：鐮刀型細(xì)胞貧血癥的形成病人的血紅蛋白的一條多肽鏈發(fā)生了什么變化？…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—……－脯氨酸－纈氨酸－谷氨酸—…正常異常第8頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四CTTGAA谷氨酸纈氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白質(zhì)正常異常GUACATGTA突變GAA_____原因_____原因根本直接點(diǎn)突變的實(shí)例：鐮刀型細(xì)胞貧血癥第9頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四與腫瘤相關(guān)的常見點(diǎn)突變類型基因生長(zhǎng)因子Sis,α-TGF,生長(zhǎng)因子受體Erb(EGFR),HER2/neu,細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)因子H-,K-,N-ras,src,raf,轉(zhuǎn)錄因子N-,c-,L-myc,c-jun,fos細(xì)胞周期因子PRAD1(cyclinD)凋亡相關(guān)基因bcl-2,bcl-X第10頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四腫瘤突變—取樣的特殊性注意事項(xiàng)：必須從腫瘤組織中取樣SampleSelectionbyLaserCaptureMicrodissection第11頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因缺失基因缺失可以是1-2個(gè)堿基，也可以是一個(gè)片段甚或一個(gè)外顯子的缺失。基因片段的缺失可使該基因激活，轉(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學(xué)功能喪失。在腫瘤發(fā)生中，多為抑癌基因的缺失。常見的抑癌基因缺失包括：RB-theretinoblastomagenp53genep16-INK4a第12頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因插入基因插入多由病毒感染造成。病毒腫瘤人類T-淋巴細(xì)胞白血病病毒I型白血病人類巨細(xì)胞病毒（CMV）血液系統(tǒng)惡性腫瘤嗜肝DNA病毒肝癌人類乳頭狀瘤病毒（HPV）宮頸癌EB病毒（EBV）鼻咽癌第13頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因異位與重排指細(xì)胞基因組中DNA順序重新排列組合的現(xiàn)象

淋巴細(xì)胞白血病

t(9;22):BCR-ABL t(12;21):TEL-AML1 t(1;19):E2A-PBX1 t(4;11):MLL-AF4

髓細(xì)胞白血病

Inv(16):CBF-MYH11 t(8;22):AML-ETO t(9;22):BCR-ABL5'partnerClass3'partnerTMPRSS2IERGTMPRSS2IETV1TMPRSS2IETV4HERV-K_22q11.23IIETV1SLC45A3IIETV1C15orf21IIIETV1HNRPA2B1IVETV1KLK2IIETV4CANT1IIETV4ACSL3IIETV1SLC45A3IIERGFLJ35294IIETV1DDX5IVETV1TMPRSS2IETV5SLC45A3IIETV5EST14IIETV1HERVK17IIETV1ETV家族常見融合基因第14頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四表觀遺傳學(xué)1.概念：基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。2.特征:(1)可遺傳；(2)可逆性；(3)DNA不變3.表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象：(1)DNA甲基化(2)組蛋白修飾(3)MicroRNA(4)Genomicimprinting(5)端粒酶第15頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四表觀遺傳學(xué)——甲基化第16頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四表觀遺傳學(xué)——組蛋白修飾組蛋白（去）乙?；疍e/Acetylation組蛋白甲基化Methylation組蛋白磷酸化Phosphorylation組蛋白泛素化Ubiquitination組蛋白糖基化ADP-Rybosilation組蛋白與Swi/Snf復(fù)合體的結(jié)合Swi/Snfcomplex,which,invitro,usestheenergyofATPhydrolysistodisrupthistone-DNAinteractions多數(shù)化學(xué)修飾的化學(xué)基團(tuán)可以減少組蛋白的正電性，從而使其與DNA結(jié)合變疏松，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。第17頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四表觀遺傳學(xué)——microRNA細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)片段的miRNA（Pri-miRNA)Drosha酶處理70－100個(gè)nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA（pre-miRNA）運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)Dicer剪切19－23個(gè)nt組成的成熟的miRNA結(jié)合到由RNA介導(dǎo)的RISC或類似相同的復(fù)合物中，參與RNA干擾，由miRNA和靶基因mRNA的堿基配對(duì)引導(dǎo)RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過程第18頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四表觀遺傳學(xué)——microRNA50％的miRNAs位于或靠近腫瘤中易發(fā)生改變的染色體區(qū)域內(nèi).常見的斷裂位點(diǎn)，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范圍內(nèi)最小擴(kuò)增區(qū)域，可能包含癌基因最小雜合子缺失區(qū)域，通常認(rèn)為抑癌基因定位在這些區(qū)域中脆性位點(diǎn)（FRA),FRA是容易發(fā)生姐妹染色質(zhì)交換，易位，缺失，擴(kuò)增的位點(diǎn)，或者質(zhì)粒DNA和腫瘤相關(guān)病毒易插入位點(diǎn)第19頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)基因重組技術(shù)

整合基因重組轉(zhuǎn)化（自然）轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)座

質(zhì)?；蚬こ藼AC（人工）YAC

基因重組第20頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因重組—整合整合：

噬菌體感染大腸桿菌的第一步噬菌體粘附于細(xì)胞壁上，將自身的DNA注入菌體中。此DNA可與細(xì)菌染色體重組，成為細(xì)菌染色體的一部分。溶原菌：整合了噬菌體基因組的細(xì)菌。裂解：噬菌體感染大腸桿菌的第二步DNA利用菌體的酶系統(tǒng)，復(fù)制自身及外殼蛋白，組裝成大量新噬菌體，并將細(xì)菌漲破。第21頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因重組—轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化第22頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因重組—轉(zhuǎn)化病毒癌基因感染宿主細(xì)胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細(xì)胞癌變。轉(zhuǎn)染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進(jìn)入菌體內(nèi)的過程。第23頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因重組—轉(zhuǎn)導(dǎo)溶原菌中DNA可以原樣地切離出來，也可以把鄰近的宿主DNA在切離時(shí)帶走一部分。后者稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。帶有宿主DNA的噬菌體稱轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。來源于宿主的基因稱轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。第24頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因重組—轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個(gè)位置。這些游動(dòng)的基因稱為轉(zhuǎn)位子(transposon)。第25頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因工程技術(shù)酶目的基因載體基因宿主基本要素基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。第26頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。第27頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體第28頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四目的基因1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（見第22章）第29頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA技術(shù)中常用的工具酶-限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第30頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第31頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第32頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四BamHⅠGATCTAGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGEcoRVGATATCCTATAGATCTAG+平端切口粘端切口第33頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。第34頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交第35頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)幾種不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)第36頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂目錄第37頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第38頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四人工染色體染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配。它需要3個(gè)關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）第39頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四人工染色體

將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動(dòng)物人工染色體(mammalianartificialchromosome)。第40頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四酵母人工染色體(YeastArtificialChromosome,YAC)第41頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)基因突變的檢測(cè)方法分子雜交技術(shù)FISHSouthernblotNorthernblot芯片雜交3.高通量基因測(cè)序技術(shù)2.基因測(cè)序技術(shù)化學(xué)降解測(cè)序Sanger測(cè)序第42頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四前列腺癌細(xì)胞中TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)（FISH法）熒光原位雜交（FISH）第43頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四Southern和Northernblot原理和應(yīng)用第44頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四Southern和Northernblot原理和應(yīng)用第45頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第46頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer第47頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第48頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第49頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第50頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第51頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第52頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介他們給DNA的測(cè)序帶來了一場(chǎng)革命，分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。后來Sanger法發(fā)展為自動(dòng)化測(cè)序法，并為人類基因組測(cè)序做出了卓越貢獻(xiàn)。FredSanger

發(fā)明的末端合成終止法(sanger法)WalterGilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法

Maxam-Gillbert法第53頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在幾組互相獨(dú)立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。第54頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四基因測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介G反應(yīng)：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應(yīng)：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應(yīng)：肼（低鹽）C反應(yīng)：肼（高鹽）測(cè)定DNA長(zhǎng)度~250bp。堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。第55頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法第56頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四末端合成終止法(sanger法)原理2‘,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與普通dNTP不同之處在于其脫氧核糖的3‘位置少一個(gè)羥基，可在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的DNA鏈中，但ddNTP因缺乏3‘羥基而不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，當(dāng)正在增長(zhǎng)的DNA鏈末端堿基為ddNTP時(shí)，則鏈延伸反應(yīng)終止，不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離，結(jié)果將產(chǎn)生4類寡核苷酸，它們分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、C、G或T的位置上。第57頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四末端合成終止法(sanger法)原理雙脫氧鏈終止法的測(cè)序基礎(chǔ)是以雙脫氧苷三磷酸為循環(huán)測(cè)序反應(yīng)的鏈終止劑。第58頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四末端合成終止法(sanger法)原理POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH第59頁，共72頁，2023年，2月20日，星期四末端合成終止法(sanger法)原理5’3’5’