原核生物基因組及其表達

第一節(jié)細菌基因組及其復制

bactiriumreplication

一、細胞中的擬核nucleoid:細菌細胞中的基因組DNA為一種很大的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它可以收縮為原來的千分之一，形成叫做擬核(nucleoid)的結(jié)構(gòu)。擬核在功能上與真核細胞的細胞核相似，但在結(jié)構(gòu)上有明顯區(qū)別?，F(xiàn)在是1頁\一共有60頁\編輯于星期二ColsedcircularDNA負超螺旋負超螺旋DNA在形成單鏈缺口后可變成松弛型DNA現(xiàn)在是2頁\一共有60頁\編輯于星期二細菌DNA也與某些特殊蛋白結(jié)合，形成類似真核生物染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)Hu蛋白與組蛋白相似,包裹DNA細菌染色體上只有一個復制啟始區(qū)(oriC)，復制過程是朝復制終點雙向進行的，所以一個細菌染色體就叫做一個復制子?，F(xiàn)在是3頁\一共有60頁\編輯于星期二二、細菌DNA復制的主要酶類細菌DNA的復制過程受許多酶或蛋白質(zhì)因子的調(diào)節(jié)，但目前對它們控制染色體復制過程的確切機制還不很清楚。根據(jù)對大腸桿菌的遺傳和生化研究，至少有18種不同基因的產(chǎn)物直接參與細菌染色體的復制過程.現(xiàn)在是4頁\一共有60頁\編輯于星期二（一）直接參與復制叉形成的蛋白質(zhì)1、單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）使DNA雙鏈松弛，但不能解螺旋，可促進。。單鏈結(jié)合蛋白與DNA高親和性地結(jié)合可以保護單鏈DNA部分不被核酸酶水解。單鏈結(jié)合蛋白可以加強單鏈DNA對DNA聚合酶的親和力，DNA聚合酶前進時，會置換出結(jié)合在單鏈上SSB蛋白。次級結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是5頁\一共有60頁\編輯于星期二2、DnaB蛋白：DNA螺旋酶(helicase)在DNA復制、修復、重組以及接合過程中，DNA兩條互補鏈必須部分分開以形成單鏈DNA中間體，即解旋。該過程是由DNA螺旋酶催化完成的。SSB，primase,四種核苷三磷酸可提高活性。螺旋酶具有依賴DNA的ATPase活性，可把ATP水解產(chǎn)生的自由能轉(zhuǎn)化為解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA鏈移動的機械能?，F(xiàn)在是6頁\一共有60頁\編輯于星期二3、DnaG引物酶---RNA聚合酶提高DnaB蛋白與模板的結(jié)合與穩(wěn)定１０－６０ｂｐ；功能？功能：合成岡崎片斷的引物RNA現(xiàn)在是7頁\一共有60頁\編輯于星期二4、DNA聚合酶ⅢpolymoraseDNA聚合酶Ⅲ是真正負責大腸桿菌細胞內(nèi)合成DNA的復制酶。

DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、δ’、χ和ψ10種不同的亞基組成?，F(xiàn)在是8頁\一共有60頁\編輯于星期二

功能：？？DNA聚合酶Ⅲ全酶在細胞中的含量很少，在每個細胞中只有10－20個拷貝的全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶Ⅲ至少含有3種重要的酶活性。即5’3’DNA聚合酶活性、3’5’外切核酸酶活性和依賴DNA的ATP酶活性。是除掉增長鏈前端的非互補的核昔酸，提高DNA合成的精確性。DNA聚合酶Ⅲ不具有5’3’外切核酸酶活性(活體內(nèi))?，F(xiàn)在是9頁\一共有60頁\編輯于星期二5、DNA聚合酶Ⅰ

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是第一個被鑒定的DNA聚合酶，它是由polA基因編碼的103kDa的單鏈多肽。當?shù)孜锖湍０宕嬖跁r，DNA聚合酶Ⅰ可使脫氧核糖核苷酸依次加到具有3’－OH末端的多核苷酸鏈上?，F(xiàn)在是10頁\一共有60頁\編輯于星期二DNA聚合酶Ⅰ是一個多功能酶，它可以催化以下的反應：？？

1、DNA鏈沿5’→3’方向的延長（DNA聚合酶活性）。2、從3’端水解DNA鏈（3’→5’外切核酸酶活性）。3、從5’端水解DNA鏈（5’→3’外切核酸酶活性）?，F(xiàn)在是11頁\一共有60頁\編輯于星期二6、DNA連接酶ligase？？

催化兩段相鄰DNA片段的3‘一OH和5’磷酸基末端的連接反應現(xiàn)在是12頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）在OriC位點起始DNA復制的蛋白質(zhì)1、Dna蛋白DnaA蛋白為一種具有復制子特異性的啟始因子，同時也是細菌DNA復制所必需的蛋白質(zhì)，它識別oriC的DNA序列，并同oriC進行特異結(jié)合。2、DnaC蛋白DnaC蛋白對DnaB與ssDNA穩(wěn)定起促進作用?，F(xiàn)在是13頁\一共有60頁\編輯于星期二3、DNA回旋酶gyrase在DNA復制的起始、延長、終止起著關鍵作用。作用：催化依賴ATPDNA超螺旋化催化依賴DNA的ATP的水解在ATP存在，催化負超螺旋的松弛。DNA拓撲異構(gòu)酶現(xiàn)在是14頁\一共有60頁\編輯于星期二

(三)終止DNA復制過程的蛋白質(zhì)

細菌DNA的復制終止過程可能需要數(shù)種不同的終止蛋白。在大腸桿菌中，染色體復制終止過程需要一種叫做Tus蛋白的終止因子?，F(xiàn)在是15頁\一共有60頁\編輯于星期二三、細菌DNA復制的模型

（一）大腸桿菌oric的結(jié)構(gòu)在這一區(qū)域中，能夠使DNA自動復制的最小片段為245bp。

現(xiàn)在是16頁\一共有60頁\編輯于星期二大腸桿菌的最小oriC序列中存在5段9bp的結(jié)構(gòu)高度保守的序列，DnaA蛋白與這5個位點結(jié)合，所以這5個位點又叫DnaA框(DnaAbox).

大腸桿菌最小oriC序列的另一特征是其中存在許多GATC位點，這種位點是Dam甲基化酶作用的目標位點，所以叫做dam位點。在oriC中還存在與膜蛋白結(jié)合的位點現(xiàn)在是17頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）細菌染色體DNA的復制1、oric組裝和活化DnaA蛋白結(jié)合——促進DnaB解螺旋和SSB蛋白與ssDNA結(jié)合——DnaG引物酶合成引物RNA——合成岡崎片斷現(xiàn)在是18頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是19頁\一共有60頁\編輯于星期二2、復制叉的延長合成引物后——延長DnaA聚合酶3和引物體——復制體replisome岡崎片斷：DnaB解螺旋、DnaG引物酶、SSB蛋白、DnaA聚合酶3復制體的兩個活動中心：現(xiàn)在是20頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是21頁\一共有60頁\編輯于星期二3、DNA復制的終止復制叉雙向移動——最后在與oriC相對的復制終止子ter終止?，F(xiàn)在是22頁\一共有60頁\編輯于星期二四、質(zhì)粒的一般特征及其復制調(diào)節(jié)

質(zhì)粒：1-多個雙鏈DNA小環(huán)，只有少數(shù)基因，依賴于主染色體獨立復制。附加體episome:也可以插入到細菌染色體中。某些質(zhì)粒和附加體可以通過conjuction細菌結(jié)合傳遞信息?，F(xiàn)在是23頁\一共有60頁\編輯于星期二拷貝數(shù)分類：singlecopyplasmidMulticopyplasmid

細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)還與質(zhì)粒的不相容性(imcompatibility)有關。質(zhì)粒不相容性是指在一組質(zhì)粒中，其成員不能共存于同一細菌細胞中的現(xiàn)象?，F(xiàn)在是24頁\一共有60頁\編輯于星期二第二節(jié)細菌基因組的轉(zhuǎn)錄與翻譯

一、與轉(zhuǎn)錄有關的酶enzyme(一)依賴與DNA的RNA聚合酶原核生物只有一種RNA聚合酶,由4-5個亞基組成。其活性受到利福平(rifampicin)和利迪鏈菌素(streptolydigin)的抑制?，F(xiàn)在是25頁\一共有60頁\編輯于星期二RNA聚合酶分子量為440kD，由4個亞基組成，各個亞基的分子量分別為160kD,150kD,70kD和40kDaδ亞基是RNA聚合酶的核心酶，它催化RNA鏈延長，現(xiàn)在是26頁\一共有60頁\編輯于星期二(二)CAP因子及其識別位點CAP(代謝降解物激活蛋白)因子與cAMP(環(huán)腺苷酸)結(jié)合的蛋白，控制某些操眾元的表達。CAP與lac識別位點結(jié)合提高轉(zhuǎn)錄水平50倍。

通常認為，CAP因子、a因子以及核心RNA相連成一線，各自覆蓋各自的識別位點.現(xiàn)在是27頁\一共有60頁\編輯于星期二(三)其它輔助因子在大腸桿菌中：1、H因子，影響聚合酶活性。H1和H2因子結(jié)合在一起時，其增效作用比單獨存在時高許多倍。2、Hu因子3、D因子現(xiàn)在是28頁\一共有60頁\編輯于星期二(四)核糖體對轉(zhuǎn)錄的作用在許多細菌中，當編碼蛋白質(zhì)的基因開始轉(zhuǎn)錄以后，核糖體必須迅速結(jié)合到延長的RNA鏈上，轉(zhuǎn)錄才能進行。mRNA.現(xiàn)在是29頁\一共有60頁\編輯于星期二在活體條件下，RNA啟始合成的位點在基因轉(zhuǎn)錄起點上游，RNA聚合酶中的δ單位與這一位點結(jié)合，形成啟始復合體，所以叫做啟動子。轉(zhuǎn)錄起點上游第10個堿基的位置，即一10位,為TATAAAT.第二段位于這一位點上游25個堿基的位置即一35位,為RNA聚合酶識別位點.二、轉(zhuǎn)錄啟始、延長與終止

(一)啟動子的結(jié)構(gòu)特征現(xiàn)在是30頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是31頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）轉(zhuǎn)錄啟始1、RNA聚合酶與啟動子結(jié)合---關閉復合體。2、關閉復合體---開放復合體—合成RNA1、活化子----CAP蛋白協(xié)助RNA聚合酶結(jié)合。NTRC蛋白，作用于前面之后。2、受DNA超螺旋影響。3、DNAmethylation，也改變轉(zhuǎn)錄頻率。

4、轉(zhuǎn)錄啟始過程還受許多其他因子的調(diào)節(jié)，特別是那些編碼分解代謝功能的操縱元，當細胞處于與某種代謝途徑有關的基質(zhì)中時，這類操縱元才能表達?，F(xiàn)在是32頁\一共有60頁\編輯于星期二（三）轉(zhuǎn)錄延長

新和成的轉(zhuǎn)錄子達8-9個核苷酸-----進入延長期。RNA鏈延長既是一種由酶催化的多聚化反應，同時也是一種拓撲學反應(topologicalreaction)。1、б因子脫離復合體,提高聚合酶活性。2、RNA聚合酶的構(gòu)型變化。3、拓撲變化。3、轉(zhuǎn)錄復合體穩(wěn)定性增加?，F(xiàn)在是33頁\一共有60頁\編輯于星期二（四）轉(zhuǎn)錄終止原核生物有2類1、內(nèi)向終止。一連串AAA2、需要р因子蛋白?，F(xiàn)在是34頁\一共有60頁\編輯于星期二（五）細菌中RNA合成與蛋白質(zhì)合成的偶聯(lián)

在同一操縱元中，一個基因的多膚鏈終止密碼對下游基因的轉(zhuǎn)錄具有重要影響。即使這些基因的編碼序列并不由任何終止密碼隔斷，其轉(zhuǎn)錄效率也非常低。這種上游基因的終止密碼干擾下游基因轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象叫做遺傳極性(geneticpolarity)。1、同一操縱元，上游基因的終止密碼對下游基因的轉(zhuǎn)錄有重要影響。2、р因子蛋白?，F(xiàn)在是35頁\一共有60頁\編輯于星期二（六）RNA轉(zhuǎn)錄后加工1、有些RNA轉(zhuǎn)錄后可直接參與蛋白的合成。2、有些RNA轉(zhuǎn)錄子含有幾個RNA，需要切割和加工。rRNA轉(zhuǎn)錄子由RNA聚合酶3切割。前體RNA中的tRNA分子由RNA聚合酶3切割。現(xiàn)在是36頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是37頁\一共有60頁\編輯于星期二三、翻譯啟始

（一）翻譯起始復合體的結(jié)構(gòu)細菌中mRNA有一個核糖體結(jié)合位點—SD序列，其同感序列為AGGAGGU，為于翻譯起始點上游幾個堿基位置。翻譯起始復合體：70S核糖體，啟始tRNA（fmet-tRNA），mRNA3種啟始因子（initiationfactor）：IF-1，IF-2，IF-3，不參與延長?，F(xiàn)在是38頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是39頁\一共有60頁\編輯于星期二（二）mRNA的次級結(jié)構(gòu)決定翻譯起始1、核糖體結(jié)合位點序列都能折疊成次級結(jié)構(gòu)，次級結(jié)構(gòu)不打開，核糖體就不能起始。現(xiàn)在是40頁\一共有60頁\編輯于星期二（三）多順反子mRNA的不等翻譯及調(diào)節(jié)1、雖然原核生物的mRNA通常都是多順反子結(jié)構(gòu)，多順反子編碼的各種蛋白不等量和成。核糖體同RNA分子上不同順反子的翻譯起點結(jié)合的速率不同。響翻譯的因素是細胞中與某些密碼子相對應的tRNA的含量很低在這些密碼上停留的時間較長，以待某些稀有tRNA擴散進來。2、在多順反子翻譯有時3’順反子比5‘順反子效率高?，F(xiàn)在是41頁\一共有60頁\編輯于星期二（四）反義RNA對翻譯的調(diào)節(jié)

1、大多數(shù)反式作用調(diào)節(jié)子都是蛋白質(zhì)，但是某些小RNA分子也可以調(diào)節(jié)基因表達。2、可通過擴散到達把位點，與其互補來調(diào)節(jié)，形成雙鏈區(qū)而行使功能。。

3、反義RNA（antisenseRNA）與mRNA結(jié)合：堵核糖體結(jié)合位點,或形成內(nèi)切核酸酶的作用為點,形成終止子?，F(xiàn)在是42頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是43頁\一共有60頁\編輯于星期二第三節(jié)操縱元的調(diào)節(jié)表達在細菌中，絕大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的基因都以操縱元的形式組織在一起，許多操縱元在調(diào)節(jié)表達方面都有相似之處，但不同操縱元也都有各自不同的結(jié)構(gòu)特點和調(diào)節(jié)表達方式?，F(xiàn)在是44頁\一共有60頁\編輯于星期二第三節(jié)操縱元的調(diào)節(jié)表達

一、操縱元調(diào)節(jié)表達的一般模型誘導操縱元:在誘導型操縱元中，有些操縱元的操作子通常與一種抑制蛋白結(jié)合，所以在正常情況下并不表達，只有當某種誘導物(一種小分子化合物)與抑制蛋白(反作用子)結(jié)合后，抑制物的構(gòu)型發(fā)生變化并脫離操作子，操縱元才能轉(zhuǎn)錄。抑制操縱元抑制型操縱元只有一種，即負控制抑制型操縱元。這種操縱元一般都能轉(zhuǎn)錄，當一種小分子的輔抑制物與一種抑制物蛋白結(jié)合后，這種復合體再結(jié)合到操作子上而抑制轉(zhuǎn)錄過程。

現(xiàn)在是45頁\一共有60頁\編輯于星期二一般來說,抑制型操縱元編碼小分子化合物和成有關的酶。誘導型操縱元編碼一些與分解代謝有關的酶。操縱元的突變研究。現(xiàn)在是46頁\一共有60頁\編輯于星期二二、乳糖操縱元的負控制和正控制誘導表達

乳糖操縱元(lacoperon)含有三個結(jié)構(gòu)基因，它們分別編碼與乳糖的吸收和分解有關的酶類。在這三個結(jié)構(gòu)基因的上游依次為操作子、啟動子、CAP蛋白結(jié)合位點以及一個編碼抑制蛋白的結(jié)構(gòu)基因即所謂的調(diào)節(jié)基因。現(xiàn)在是47頁\一共有60頁\編輯于星期二由lac操縱元編碼的酶的合成既可以被誘導也可以被抑制。如果將大腸桿菌細胞在只以葡萄糖作為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其細胞中乳糖滲透酶的活性都很低。如果將這些細胞再轉(zhuǎn)移到含有乳糖的培養(yǎng)基上，則乳糖滲透酶的活性在20分鐘內(nèi)可增加一千倍。如果將細菌從含有乳糖的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有葡萄糖的培養(yǎng)基上，乳糖滲透酶合成則迅速被關閉或被抑制。lac操縱元控制表達有兩種方式，第一種方式是當培養(yǎng)基中存在乳糖時，抑制蛋白脫離操作子，這就是所謂的抑制蛋白的負控制誘導;第二種方式是由CAP蛋白與DNA結(jié)合所調(diào)節(jié)的正控制誘導。現(xiàn)在是48頁\一共有60頁\編輯于星期二三、色氨酸操縱元與弱化反應attenuation

細菌基因組中存在數(shù)種與氨基酸合成有關的操縱元，其轉(zhuǎn)錄既可以受氨基酸自身的抑制，也可以受有關氨基酸衍生物的抑制，所以只要培養(yǎng)基中有足量氨基酸存在，這些操縱元就無須表達。色氨酸本身并不是一種誘導物，而是一種輔抑制物，即它活化一種特殊的抑制物，從而阻止色氨酸操縱元的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在是49頁\一共有60頁\編輯于星期二弱化作用(attenuation)：當色氨酸含量豐富，載有色氨酸的氨酞tRNA濃度高時，由前導序列中可讀框編碼的RNA能夠正常翻譯，從而抑制trp操縱元的其他部分轉(zhuǎn)錄，所以就把這種現(xiàn)象叫做。而把這段能中止RNA轉(zhuǎn)錄的區(qū)域叫做弱化子或弱化基因(attenuator)?，F(xiàn)在是50頁\一共有60頁\編輯于星期二Trpoperon結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是51頁\一共有60頁\編輯于星期二四、核糖體蛋白操縱元與翻譯自動調(diào)節(jié)

在大腸桿菌中，70s核糖體由55種不同蛋白質(zhì)組成，其中大亞基有31，編碼這些蛋白質(zhì)的基因連鎖在幾個不同的操縱元中。現(xiàn)在知道，大腸桿菌中所有核糖體蛋白都是等量合成，但其合成的調(diào)節(jié)機制目前還不很清楚。現(xiàn)在是52頁\一共有60頁\編輯于星期二所有核糖體蛋白成分都不是來自同一操縱元，編碼rRNA的基因和核糖體蛋白的基因分散在細菌染色體的不同區(qū)域。協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)和rRNA合成的機制是，在核糖體形成過程中，某些核糖體蛋白結(jié)合到rRNA的某些特定區(qū)域，當rRNA上的結(jié)合位點全部被占用后，游離的核糖體蛋白就結(jié)合到自身的mRNA3端的有關位點上，阻止其mRNA進一步翻譯。因此，這些核糖體蛋白又調(diào)節(jié)其自身mRNA的翻譯.現(xiàn)在是53頁\一共有60頁\編輯于星期二現(xiàn)在是54頁\一共有60頁\編輯于星期二五、轉(zhuǎn)錄的總體控制stringentresponse嚴謹反應：將在營養(yǎng)豐富的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)醫(yī)乏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細菌細胞對這種環(huán)境壓就會作出反應，