皮膚科細(xì)胞培養(yǎng)及臨床應(yīng)用

皮膚病學(xué)相關(guān)研究中

所涉及的細(xì)胞培養(yǎng)問題中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所李新宇2004年2月2023/4/61.細(xì)胞培養(yǎng)涉及的基本知識(shí)2023/4/62.最常見的兩種生長(zhǎng)型細(xì)胞貼壁依賴性細(xì)胞(Anchorage-dependentcells)

貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)(玻璃、或塑料等無活性物質(zhì))的表面生長(zhǎng)、生存和維持。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞(Suspensionculture)

細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。2023/4/63.細(xì)胞培養(yǎng)中常用的幾個(gè)術(shù)語細(xì)胞系(Cellline)：

原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系。連續(xù)傳代連續(xù)傳代

連續(xù)細(xì)胞系有限細(xì)胞系

(已建成的細(xì)胞系)

2023/4/64.細(xì)胞株(Cellstrain):

由具有某些特性與標(biāo)志的細(xì)胞選擇或克隆化而派生的亞系。細(xì)胞周期(Cellcycle)

細(xì)胞前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)相過程。

4個(gè)時(shí)期：S期：DNA合成期

M期：有絲分裂期

G1期：有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期

G2期：DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期

G0期：某種原因?qū)е录?xì)胞不再沿周期進(jìn)行，進(jìn)入休眠狀態(tài)2023/4/65.細(xì)胞一代時(shí)間(Cellgenerationtime)

單個(gè)細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時(shí)間間隔。群體倍增時(shí)間(Populationdoublingtime)

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行計(jì)算的細(xì)胞增加一倍所需要的時(shí)間。2023/4/66.克隆(Clone)

單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體，它們的遺傳特性相同。細(xì)胞融合(Cellfusion)

體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使不同體細(xì)胞融合成雜交細(xì)胞(Hybrid)。細(xì)胞匯合(Confluence)

器皿中培養(yǎng)的細(xì)胞彼此匯合形成單層。2023/4/67.原代培養(yǎng)(Primaryculture)

從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(Passage)(Subculture)

細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。再培養(yǎng)(Reculture)

單層細(xì)胞不經(jīng)任何丟失而轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中的過程。2023/4/68.集落形成率(Platingefficiency)

細(xì)胞接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)所形成的集落的百分率。

單個(gè)細(xì)胞集落克隆形成率(Cloningefficiency)群體密度(Populationdensity)

培養(yǎng)器皿內(nèi)，每單位面積或體積中的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/cm2)。飽和密度(Saturationdensity)

特定條件下，培養(yǎng)器皿中能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)

(細(xì)胞數(shù)/cm2或細(xì)胞數(shù)/cm3)。2023/4/69.培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)(MEM)

無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基血清基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)完全培養(yǎng)基2023/4/610.基本培養(yǎng)基的組分

四大類物質(zhì)無機(jī)鹽氨基酸維生素碳水化合物

pH指示劑酚紅2023/4/611.常用基本培養(yǎng)基

RPMI1640應(yīng)用最廣泛

DMEM高糖型4500g/L葡萄糖，低糖型1000g/L葡萄糖

HamF12無血清培養(yǎng)基常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基

199……2023/4/612.培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)細(xì)胞的首選培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞株特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)需要選擇用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)選擇2023/4/613.培養(yǎng)基配制時(shí)的注意事項(xiàng)

嚴(yán)格按說明書要求添加必要成分

NaHCO3

谷氨酰胺

HEPES------

各成分順序溶解配制培養(yǎng)基用水、器皿滅菌分裝、保存

2023/4/614.培養(yǎng)基添加成分

NaHCO3

一般按說明書要求添加封閉式培養(yǎng)用5.6%或7.4%液調(diào)節(jié)谷氨酰胺易降解，使用前添加使用終濃度0.002mol/LHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)

主要作用為防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)使用終濃度0.01-0.015mol/L2023/4/615.完全培養(yǎng)基的添加成分牛血清

小牛血清：取自出生10～30天的小牛。新生牛血清：取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛。胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎牛或心臟穿刺方法獲得。

2023/4/616.血清的主要作用

提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

(激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白)

提供貼壁和擴(kuò)展因子(纖連蛋白,層粘連蛋白)。對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供保護(hù)作用。

抗蛋白酶成分對(duì)細(xì)胞釋放的蛋白酶起中和作用終止貼壁細(xì)胞消化傳代中所用胰蛋白酶的作用血清蛋白的粘度保護(hù)懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)細(xì)胞所受的機(jī)械損傷2023/4/617.使用血清的缺點(diǎn)

改變細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)促進(jìn)某些細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長(zhǎng)。所含物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響或毒性作用批間成分的一致性支原體、病毒的潛在污染性2023/4/618.血清質(zhì)量的判斷

質(zhì)量鑒定報(bào)告理化性質(zhì)微生物檢測(cè)

促生長(zhǎng)效果(培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè))

克隆形成率、貼壁率測(cè)定連續(xù)傳代培養(yǎng)

外觀判斷

透明清亮土黃色或棕黃色無沉淀或及少量沉淀較粘稠2023/4/619.血清的使用與貯存

滅活處理:56℃水浴,30分鐘(去除補(bǔ)體)

貯存條件:分裝

-20℃長(zhǎng)期貯存,避免反復(fù)凍融

4℃,<1個(gè)月融化步驟:-20℃4℃室溫使用濃度:5%～20%,常用10%

臨用前添加于培養(yǎng)基中

2023/4/620.無血清培養(yǎng)基用途觀察生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的作用,需排除其它生長(zhǎng)因子的干擾作用

測(cè)定細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力

大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞，獲得分泌產(chǎn)物

2023/4/621.無血清培養(yǎng)基的組成

基礎(chǔ)培養(yǎng)基

HamF12:DMEM=1:1

添加組分

促貼壁物質(zhì)（細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白,層粘連蛋白）促生長(zhǎng)因子及激素酶抑制劑（終止胰酶消化作用，保護(hù)細(xì)胞，如大豆胰酶抑制劑）

……2023/4/622.更換無血清培養(yǎng)基的注意事項(xiàng)針對(duì)性強(qiáng)直接適應(yīng)連續(xù)適應(yīng)逐步降低血清濃度

2023/4/623.無蛋白培養(yǎng)基(PFM)

不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基，以添加植物水解物替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子。

用途

生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)2023/4/624.

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(CDM)

培養(yǎng)基中所有成分明確，不含動(dòng)物蛋白，也不添加植物水解物，而使用一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物(短肽、植物激素等)。用途

分析細(xì)胞分泌產(chǎn)物2023/4/625.

細(xì)胞培養(yǎng)中的其它用液平衡鹽溶液

PBSHank’s液

D-Hank’s液

------2023/4/626.消化液

胰酶溶液(0.1～0.25%)D-Hank’s液配制最佳pH值：8～9

EDTA溶液(0.02%)

用于解離細(xì)胞(破壞細(xì)胞間的連接)

與胰酶混合用于消化貼壁牢的細(xì)胞

膠原酶溶液(0.1～0.3mg/L)

不易損傷細(xì)胞，不受Ca2+

、Mg2+及血清抑制2023/4/627.細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)測(cè)定血細(xì)胞計(jì)數(shù)法

細(xì)胞密度(個(gè)/ml)=平均細(xì)胞數(shù)×104×稀釋倍數(shù)

影響方法精確性的因素

貼壁細(xì)胞消化的時(shí)間細(xì)胞懸液的均勻性細(xì)胞濃度合適2023/4/628.臺(tái)盼藍(lán)染色法

正常細(xì)胞不染色，死亡細(xì)胞呈藍(lán)色。

細(xì)胞活力(%)=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))÷總細(xì)胞數(shù)×100%

注意為一種粗略的檢測(cè)存活細(xì)胞的方法，不能準(zhǔn)確放映細(xì)胞活力差異。判斷時(shí)間2023/4/629.MTT比色法

活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑鹽(MTT)，還原成紫色不溶性結(jié)晶物，沉積于細(xì)胞中。用酸性異丙醇或DMSO溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值。紫色不溶性結(jié)晶物形成的多少與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)相關(guān)。

細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組光吸收值÷對(duì)照組光吸收值×100%

MTT法特點(diǎn)高濃度血清的影響簡(jiǎn)便迅速。不接觸同位素，敏感性與同位素法接近。

2023/4/630.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法

可觀察同一代細(xì)胞的增殖過程。根據(jù)生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞增殖速度，確定具體實(shí)驗(yàn)﹑細(xì)胞傳代的最佳時(shí)間。

方法總培養(yǎng)時(shí)間7天計(jì)數(shù)每24小時(shí)細(xì)胞數(shù)目繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

潛伏期原代細(xì)胞24-96h

傳代細(xì)胞6-24h

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

3-5d

倍增時(shí)間

停滯期

2023/4/631.3H-TdR摻入法

3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到細(xì)胞新合成的DNA中，通過測(cè)定3H放射性脈沖數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的增殖活性。

特點(diǎn)被標(biāo)記的細(xì)胞為S期細(xì)胞，3H-TdR摻入量放映DNA合成的快慢。放射性損害。需要特殊實(shí)驗(yàn)室和特殊設(shè)備。2023/4/632.細(xì)胞培養(yǎng)中的傳代換液?jiǎn)栴}原代培養(yǎng)后的第一次傳代原代培養(yǎng)方法細(xì)胞活性細(xì)胞類型和特點(diǎn)接種密度培養(yǎng)條件常規(guī)傳代傳代時(shí)間對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代比例原瓶細(xì)胞分于2-4瓶貼壁細(xì)胞酶充分消化2023/4/633.二.角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)問題2023/4/634.

角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法

組織塊培養(yǎng)法

3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法膠原為滋養(yǎng)層培養(yǎng)法氣—液交界面培養(yǎng)法無血清培養(yǎng)法2023/4/635.組織塊培養(yǎng)法

將表皮塊貼附在培養(yǎng)瓶壁上,角質(zhì)形成細(xì)胞逐漸從組織塊邊緣爬行長(zhǎng)出。特點(diǎn)

穩(wěn)定可靠獲得的細(xì)胞數(shù)量有限細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)成纖維細(xì)胞污染2023/4/636.3T3細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法

3T3細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C或γ-射線預(yù)處理(失去分裂增殖功能)后,低密度接種在培養(yǎng)瓶壁上,再將角質(zhì)形成細(xì)胞種植在此細(xì)胞滋養(yǎng)層上。

3T3細(xì)胞

小鼠胚胎瘤成纖維細(xì)胞株滋養(yǎng)層作用促使角質(zhì)形成細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng),并形成集落,最后融合成復(fù)層鱗狀上皮接觸性抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)

2023/4/637.3T3細(xì)胞促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的途徑:

產(chǎn)生基質(zhì)成分,促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞貼壁。分泌促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞有絲分裂的活性因子。通過細(xì)胞間相互作用,調(diào)節(jié)與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖相關(guān)的生物因子。

2023/4/638.3T3細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)法特點(diǎn)

細(xì)胞接種密度低、增殖速度快且細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定。

3T3細(xì)胞逐漸被擠壓,隨著角質(zhì)形成細(xì)胞集落不斷擴(kuò)大形成冠狀,然后被壓縮成條索狀,最后脫落且消失。

3T3細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)分泌異種蛋白和抗原,用它作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞或人工表皮,移植后可能引起異種排斥反應(yīng)。培養(yǎng)過程中角質(zhì)形成細(xì)胞角化明顯。

改進(jìn)法：向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、能增加細(xì)胞內(nèi)

cAMP水平的試劑（霍亂毒素等）。2023/4/639.膠原滋養(yǎng)層培養(yǎng)法

角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁率玻璃培養(yǎng)瓶2.8%～7%,

塑料培養(yǎng)瓶14%

預(yù)鋪膠原的塑料培養(yǎng)瓶70%～80%2023/4/640.膠原促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)的機(jī)制細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,促進(jìn)細(xì)胞貼壁。覆蓋培養(yǎng)瓶壁上不利于角質(zhì)形成細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)的化學(xué)基團(tuán)。為角質(zhì)形成細(xì)胞提供粘附所需的特異性化學(xué)基團(tuán)。為角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必要營(yíng)養(yǎng)。2023/4/641.氣—液界面培養(yǎng)法

使表皮細(xì)胞在更接近正常人體的生理狀態(tài)下生長(zhǎng)和分化。培養(yǎng)皿內(nèi)加上一層鋪墊,再將皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞接種其上,加入的培養(yǎng)液不超過鋪墊水平,細(xì)胞通過鋪墊吸收營(yíng)養(yǎng)維持其生長(zhǎng)發(fā)育。(接種在鋪墊上的細(xì)胞先進(jìn)行浸泡性培養(yǎng)，一定時(shí)間后鋪墊支架升到氣-液界面繼續(xù)培養(yǎng)，使角質(zhì)形成細(xì)胞完成終末分化。)

2023/4/642.

鋪墊動(dòng)物或人的尸體的皮膚真皮玻璃纖維片膠原膜或尼龍網(wǎng)膠原膜和尼龍網(wǎng)的貼合物。

Transwell培養(yǎng)皿特點(diǎn)

能培養(yǎng)出多層類似正常皮膚的細(xì)胞層次，與正常皮膚非常接近。2023/4/643.無血清培養(yǎng)法

含血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法特點(diǎn)

必須在培養(yǎng)液中加入一定比例的血清以利于細(xì)胞生長(zhǎng),但所含因素變化大,不明因素多,成份復(fù)雜。影響角質(zhì)形成細(xì)胞生理和病理生理等的精細(xì)研究(對(duì)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制,培養(yǎng)表皮細(xì)胞因子的釋放,特殊抗原和受體的表達(dá)研究等)。

2023/4/644.

無血清培養(yǎng)法特點(diǎn)

技術(shù)要求較高。培養(yǎng)基中需添加牛腦垂體提取物(WBPE)或豬腦垂體提取物(PWPE)。排除了復(fù)雜的血清成分對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的不利因素影響。為角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì)。2023/4/645.MCDB153無血清培養(yǎng)基角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。適用于低密度接種的傳代表皮細(xì)胞的生長(zhǎng),但原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞克隆形成率較低,不能滿足較高密度細(xì)胞生長(zhǎng)的需要。細(xì)胞以單層方式向外生長(zhǎng),但細(xì)胞之間缺乏橋粒連接,不能形成表皮皮片。培養(yǎng)液中的牛腦垂體提取物或豬腦垂體提取物價(jià)格昂貴，瘋牛病的危險(xiǎn)。2023/4/646.角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(DKSFM,Gibco

)

去除牛腦垂體提取物。保留對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用,同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。角質(zhì)形成細(xì)胞貼壁快,增殖迅速,細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后,呈現(xiàn)出典型的鋪路石狀,細(xì)胞呈多角形。細(xì)胞免疫組化染色抗角蛋白抗體染色陽(yáng)性。整個(gè)培養(yǎng)周期中,角質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出基底細(xì)胞形狀,細(xì)胞表面沒有分泌物。操作簡(jiǎn)便易行,安全適用,避免了以膠原或3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層法的缺點(diǎn)。2023/4/647.影響角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的因素皮膚標(biāo)本的來源

正常人外科包皮環(huán)切手術(shù)棄之皮膚標(biāo)本運(yùn)輸和保存

無菌容器

短時(shí)間存放于平衡鹽溶液,長(zhǎng)時(shí)間存放于營(yíng)養(yǎng)液中。標(biāo)本預(yù)處理

清洗、去除組織、剪切2023/4/648.表皮和真皮的分離

胰蛋白酶

分離基底細(xì)胞和上面的細(xì)胞。既破壞橋粒又破壞半橋粒結(jié)構(gòu)。消化時(shí)間過長(zhǎng),丟失部分基底細(xì)胞。消化時(shí)間過短,表皮和真皮分離不完全,混有成纖維細(xì)胞。2023/4/649.中性蛋白酶

主要分解IV型膠原和纖維粘連蛋白。作用于表皮和真皮的結(jié)合處。只破壞半橋粒結(jié)構(gòu)。獲得的角質(zhì)形成細(xì)胞活力較高,增殖迅速,融合成片的速度快。減少成纖維細(xì)胞污染?？色@得含有完整基底層細(xì)胞的表皮。

Dispase(GIBCO)

中性蛋白酶分離表皮和真皮,再用胰蛋白酶消化表皮成為單個(gè)的細(xì)胞。2023/4/650.培養(yǎng)液中主要的添加物

胰島素氫化可的松三碘甲狀腺原氨酸霍亂毒素轉(zhuǎn)鐵蛋白表皮生長(zhǎng)因子

……2023/4/651.主要添加物的作用促進(jìn)細(xì)胞的葡萄糖和氨基酸的吸收。促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖。促進(jìn)細(xì)胞的合成代謝。提高細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP水平。降低鐵離子對(duì)細(xì)胞的毒性。促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的有絲分裂。2023/4/652.鈣離子濃度

與表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的多層化有關(guān),鈣離子濃度低至一定濃度時(shí),細(xì)胞的分層現(xiàn)象消失。低鈣(0.05～0.15mM)時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞不分化,

細(xì)胞增殖最佳;當(dāng)鈣離子濃度上升到1.0mM時(shí),

角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生分化,顯示生長(zhǎng)。2023/4/653.角質(zhì)形成細(xì)胞株(系)應(yīng)用

COLO-16株

來自于鱗狀上皮癌的人角質(zhì)形成細(xì)胞。

HaCaT株

永生化的正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(>140

代)。2023/4/654.三.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在皮膚病相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2023/4/655.

微載體培養(yǎng)細(xì)胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長(zhǎng),通過輕輕攪拌使細(xì)胞維持懸浮狀態(tài)。

特點(diǎn)不增加培養(yǎng)容器表面積或培養(yǎng)基容積的前提下提高培養(yǎng)表面積。

省卻了容器等的清洗和準(zhǔn)備工作。細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離簡(jiǎn)單。減少繁復(fù)的操作步驟,降低污染率。提高產(chǎn)率。

微載體制作材料的進(jìn)展

葡聚糖纖維素

聚乙烯和二氧化硅,聚苯乙烯明膠2023/4/656.在化妝品功效研究中的應(yīng)用

傳統(tǒng)皮膚細(xì)胞培養(yǎng)方法的應(yīng)用

單層ＫＣ的培養(yǎng)技術(shù)---皮膚組織獲取和化妝品研發(fā)

培養(yǎng)黑素細(xì)胞---美白化妝品活性成分篩選朗格罕細(xì)胞、ＫＣ和Ｔ淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)

---體外篩選化妝品過敏作用

富含Merkel細(xì)胞的表皮細(xì)胞懸液培養(yǎng)

---局部應(yīng)用藥物的耐受機(jī)制研究2023/4/657.成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

---抗衰老化妝品活性成分開發(fā)中應(yīng)用(篩選中草藥有效成分的抗衰老活性)---化妝品生理功效研究中應(yīng)用

2023/4/658.皮膚細(xì)胞的“三維培養(yǎng)”

器官型培養(yǎng)(氣-液體交界面ＫＣ培養(yǎng))

分離、培養(yǎng)皮膚的ＫＣ,使其在體外擴(kuò)增,然后將其接種于真皮類似物上,暴露于空氣中,使表皮正常分化,形成類似天然表皮的復(fù)層組織(體外重建表皮)。真皮類似物去表皮真皮膠原基質(zhì)惰性材料

應(yīng)用

真皮類似物和重建表皮的組合形成具有表皮和真皮的簡(jiǎn)化的人皮膚。用成纖維細(xì)胞研究從表皮透過的化妝品活性物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng),了解表、真皮之間的相互作用。將其他細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞)引入真皮類似層,擴(kuò)大測(cè)試系統(tǒng)的使用范圍。2023/4/659.皮膚器官培養(yǎng)

活體皮膚于體外培養(yǎng)，并使其保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能。

培養(yǎng)方法

液體浸沒的皮膚器官培養(yǎng)氣-液面交界的皮膚器官培養(yǎng)

應(yīng)用化妝品對(duì)皮膚急性刺激毒性研究2023/4/660.

在化妝品研發(fā)中的應(yīng)用

延緩皮膚衰老化妝品

以皮膚ＫＣ和成纖維細(xì)胞為受試對(duì)象,尋找或篩選具有抗衰老活性物質(zhì),確定該物質(zhì)基本毒性情況。(觀察對(duì)兩種細(xì)胞增殖能力及活性的影響)

研究外界因素對(duì)皮膚的藥理學(xué)或毒理學(xué)作用。

(如ＵＶ、藥物及化妝品等)

將損傷作用作為模型進(jìn)行化妝品的干預(yù)研究

2023/4/661.皮膚美白產(chǎn)品

將活的黑色素細(xì)胞引入重建真皮類似環(huán)境，作為體外皮膚美白劑的初篩模型。光生物學(xué)研究,如防曬劑的效果評(píng)價(jià)。

2023/4/662.化妝品配方及成品的毒理學(xué)研究

單層皮膚細(xì)胞培養(yǎng)外來化學(xué)物的代謝及最初的刺激和過敏反應(yīng)。

皮膚三維培養(yǎng)化妝品的細(xì)胞毒性、有效性研究及局部應(yīng)用化合物(藥用化妝品、表面活性劑、滲透劑和殺菌劑等)效果評(píng)價(jià)。

2023/4/663.毛發(fā)用化妝品

以毛根鞘上皮細(xì)胞為對(duì)象,進(jìn)行護(hù)發(fā)活性物質(zhì)的篩選以及毛發(fā)用化妝品毒性測(cè)試研究。2023/4/664.基礎(chǔ)研究

皮膚三維培養(yǎng)(重建表皮、真皮類似物)---化妝品和洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品對(duì)人體皮膚的刺激性研究

---重建表皮可用于研究表皮終末分化以及研究表皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)物、表皮對(duì)刺激反應(yīng)機(jī)制；化妝品經(jīng)皮吸收和化妝品對(duì)屏障功能的保護(hù)作用

---真皮類似物用來研究真皮層的組成及生理功能

---重建表皮+真皮類似物共培養(yǎng)系統(tǒng)用來研究皮膚生理代謝、化合物的光毒性、ＵＶ效應(yīng)和防曬劑的作用2023/4/665.體外細(xì)胞培養(yǎng)模型

角質(zhì)形成細(xì)胞黑色素細(xì)胞朗罕氏細(xì)胞成纖維細(xì)胞皮脂細(xì)胞2023/4/666.細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)估方法及指標(biāo)

評(píng)估目的細(xì)胞模型評(píng)估指標(biāo)

毒性2,3-Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞活性

(中性紅MTT,LDH,PEG2)

美白黑素細(xì)胞培養(yǎng)黑素的生成黑素細(xì)胞和酪氨到酶活性角朊細(xì)胞共培養(yǎng)

3-Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)抗衰老成纖維細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖,膠原蛋白,

角朊細(xì)胞培養(yǎng)彈性蛋白,3-Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)粘多糖等的生成2023/4/667.在基因工程藥物血藥

濃度測(cè)定中的應(yīng)用

特定依賴細(xì)胞株培養(yǎng)法

以藥物對(duì)特定依賴細(xì)胞的增殖或抑制、細(xì)胞數(shù)目的增減為量效指標(biāo)。細(xì)胞增殖法:促進(jìn)特定依賴細(xì)胞株增殖,

抑制增殖法:抑制細(xì)胞增殖

2023/4/668.細(xì)胞培養(yǎng)量效指標(biāo)的測(cè)定方法

[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法(3H-TdR)59Fe核素標(biāo)記法四氮唑鹽法(MTT)

直接計(jì)數(shù)法其他間接法2023/4/669.細(xì)胞毒性的觀察方法

放射性同位素?cái)z入法

3H-胸腺嘧啶--

3H-亮氨酸--培養(yǎng)基中摻入3H-亮氨酸，根據(jù)3H-亮氨酸在細(xì)胞內(nèi)含量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成情況。

同位素法特點(diǎn)揭示細(xì)胞分子水平的動(dòng)態(tài)變化,是研究細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要手段。放射性損害。需要特殊實(shí)驗(yàn)室和特殊設(shè)備。

四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)

2023/4/670.

熒光染色法

乙酰乙酸熒光素法

當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),細(xì)胞膜的選擇通透性屏障作用消失,利用乙酰乙酸熒光素和溴化乙錠快速