工業(yè)微生物育種誘變劑優(yōu)秀公開課件

第五章工業(yè)微生物育種誘變劑5.1物理誘變劑5.2化學(xué)誘變劑5.3生物誘變劑通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物以引起突變，這一過程稱為誘發(fā)突變。誘發(fā)突變(inducedmutation)的發(fā)現(xiàn)1927年，Muller

用X射線誘發(fā)果蠅遺傳性狀變異。在第二次世界大戰(zhàn)中，又發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)氮芥也能導(dǎo)致細菌性狀變異，其效應(yīng)與X射線相類似。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多物理因子與化學(xué)物質(zhì)都具有誘發(fā)基因突變的作用。近年來，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)工程中點突變的重要技術(shù)——基因誘變在菌種選育中得以應(yīng)用，使生物誘變劑受到了重視，取得了可喜的發(fā)展。誘變：誘變劑種類物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑誘變劑：凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠遠超過自發(fā)突變率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)誘變劑的概念與種類什么是誘變劑？有哪些分類？1.1

物理誘變劑的種類物理輻射電離輻射產(chǎn)生正離子非電離輻射不產(chǎn)生離子X射線0.06~136nmγ射線0.006~1.4nm紫外線136~390nm物理誘變劑包括：紫外線，X射線，γ射線，快中子，α射線，β射線，微波，超聲波，電磁波，激光射線和宇宙射線等。指的是能量以電磁波或粒子（如阿爾法粒子、貝塔粒子等）的形式向外擴散。高能電磁波波長短于紫色光的肉眼不可見“光線”輻射1.2物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)1.輻射作用的時相階段：物理誘變劑對微生物的誘變作用主要是由高能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過程，通?？煞譃槲锢?、物理－化學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)四個階段。2.分子結(jié)構(gòu)變化:由輻射引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化中最常發(fā)生的是DNA單鏈或雙鏈斷裂：單鏈斷裂：多于雙鏈斷裂，易被修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)。雙鏈斷裂：一部分也可以通過修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，但雙鏈斷裂易使染色體發(fā)生畸變或者使微生物死亡。1.2物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)3.生物學(xué)效應(yīng)與輻射類型的關(guān)系電離輻射：主要引起DNA上的基因突變和染色體的畸變。非電離輻射：主要導(dǎo)致形成嘧啶二聚體。與輻射劑量的關(guān)系引起微生物的變異或死亡與輻射劑量成正比在相同的總輻射劑量的條件下，不論是一次連續(xù)照射還是分次累加照射，也不論是高劑量短時間照射還是低劑量長時間照射，其誘變效應(yīng)基本上是相等的。切爾諾貝利核爆炸2011年3月11日爆發(fā)的9.0級特大地震影響，日本福島核電站反應(yīng)堆發(fā)生氫氣爆炸1.3輻射引起生物效應(yīng)的因素

輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的強弱既決定于微生物內(nèi)在遺傳因素，也受外界環(huán)境條件的影響。微生物因素:1.微生物的遺傳背景:不同菌種由于遺傳性狀各異，對輻射的敏感性亦各不相同。如：A和T比例高，對紫外線越敏感，對電離輻射則相反。2.微生物的生理狀態(tài)：微生物細胞壁結(jié)構(gòu)、修復(fù)系統(tǒng)的強弱環(huán)境因素:1.可見光：能激活光復(fù)活酶的活性，分解紫外線引起的嘧啶二聚體2.水分：含水量影響細胞對輻射的敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感3.溫度：較高的溫度能促進氧氣與自由基之間的作用,使射線與DNA接觸過程所引起的化學(xué)反應(yīng)加速4.空氣或氧氣：有氧比缺氧時的電離輻射效應(yīng)更好1.4非電離輻射——紫外線136-390nm1.4非電離輻射——紫外線紫外線的誘變機制和DNA損傷修復(fù)單鏈上的二聚體會影響到復(fù)制時的堿基正常配對。雙鏈上的二聚體會阻礙雙鏈的分開，復(fù)制到這一點就無法繼續(xù)進行，造成DNA鏈的異常。紫外線的誘變機制形成嘧啶二聚體DNA損傷修復(fù)光修復(fù),

切補修復(fù)（暗修復(fù)）1.4非電離輻射——紫外線2.紫外線誘變(1)紫外線的有效光譜DNA吸收的紫外線光譜通常為260nm，因此能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長范圍是200～300nm，最有效的波長為253.7nm(2537?)。一般用來滅菌消毒的30W紫外燈管，光譜分布范圍廣，誘變效率較差；而15W紫外燈管產(chǎn)生的紫外線大約有80％波長集中在2537?，因此誘變效應(yīng)比30W的好。(2)紫外線的輻射劑量絕對劑量：單位用erg/mm2(1erg=10–7J)，需要用一種劑量儀來測定，由于操作比較困難，實際工作中應(yīng)用較少。相對劑量：單位用照射時間或殺菌率表示劑量決定于紫外燈的功率、燈管與被照射微生物的距離及照射時間。在燈的功率和燈管的距離固定的情況下，劑量大小則由照射時間決定。用紫外線的殺菌率表示時，一般認為90～99.9％效果較好。1.4非電離輻射——紫外線(3)紫外線照射的策略：最適劑量因微生物而異，紫外照射劑量與殺菌率在一定范圍內(nèi)成正比。①使用15W紫外燈2支，安裝于鍍鉻燈罩內(nèi)，使2537?光波集中于被處理的微生物細胞，可以提高變異率。②將照射劑量提高到超致死量的程度，與可見光交替進行，利用光修復(fù)使損傷的細胞恢復(fù)，減少死亡率，增加變異幅度。一般采用30W紫外燈管，光復(fù)活的效果較好，或者在預(yù)培養(yǎng)基中增加一定量的咖啡因或蛋白胨，也可以降低死亡率。2.紫外線誘變1.4非電離輻射——紫外線2.紫外線誘變④紫外線照射：紫外燈預(yù)熱20min，以穩(wěn)定光波，邊攪拌邊照射，細胞均勻吸收紫外線。為避免光修復(fù)，在照射的過程中要在暗室完成，僅可打開黃色或紅色燈。另據(jù)國外報道，經(jīng)過紫外線誘變后的菌體可以轉(zhuǎn)入到無菌試管內(nèi)，并立即浸入冰水中1~2h，在低溫的條件下，細胞內(nèi)參與突變修復(fù)的各種酶類的活性受到抑制，使修復(fù)難以進行。⑤后培養(yǎng)：照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體增殖的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)1.5~2h。有些微生物在此階段還可加入酪素水解物、色氨酸或異煙肼等物質(zhì)來抑制修復(fù)。⑥稀釋涂皿：后培養(yǎng)物，作不同程度的稀釋，進行涂板培養(yǎng)和篩選。1.5電離輻射1.電離輻射的種類、特性與來源X射線波長是0.06~136納米，X射線一般由X光機產(chǎn)生。γ射線的波長是0.006~1.4納米，γ射線來自放射性元素鈷、鐳或氡等。中子可以從回旋加速器、靜電加速器或原子反應(yīng)堆中產(chǎn)生快中子具有的能量最高，為0.2~10MeV電離輻射誘變機理

直接作用：打斷化學(xué)鍵間接作用：通過自由基打斷化學(xué)鍵，引起缺失和損傷效應(yīng)：染色體畸變，堿基置換，移碼突變1.5電離輻射2.電離輻射的誘變機理1.5電離輻射3.電離輻射劑量快中子劑量常用拉德(rad)表示，指1g被照射物質(zhì)吸收100erg輻射能量的射線劑量；可轉(zhuǎn)換為倫琴(R)。在誘變育種中快中子照射的致死率為50～85％較合適，產(chǎn)生的正突變率可達50%，采用的誘變劑量大約在15～30krad。其作用機理是由中子穿過物質(zhì)時把原子核中的質(zhì)子撞擊出來。由于快中子產(chǎn)生較大的電離密度，能有效地導(dǎo)致基因突變和染色體畸變，所以快中子對微生物誘變育種是較理想的。1.5電離輻射4.電離輻射的照射方法直接對平皿上生長的菌落進行照射；用打孔器將菌落連瓊脂一同取出，置于滅菌平皿內(nèi)進行照射；制成菌懸液，取1～2ml置于試管內(nèi)，浸入冰水中，從上、側(cè)或下面進行短時間照射。低溫可以降低或抑制修復(fù)酶的活性，防止突變體因修復(fù)酶的修復(fù)而還原為正常細胞。第二節(jié)化學(xué)誘變劑5.2.1化學(xué)誘變劑的一般特點5.2.2化學(xué)誘變劑的類型:

堿基類似物烷化劑脫氨劑移碼誘變劑羥化劑金屬鹽類其他化學(xué)誘變劑2.1化學(xué)誘變劑的一般特點化學(xué)誘變劑往往具有專一性，對基因的某部位發(fā)生作用，對其余部位則無影響?；瘜W(xué)誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時間。絕大多數(shù)化學(xué)誘變劑都具有毒性。定義：一類能對DNA起作用，改變DNA結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。

在DNA復(fù)制過程中取代正常堿基，整合進DNA分子它們產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，出現(xiàn)堿基錯配的概率也高堿基類似物是如何提高突變頻率的?2.2堿基類似物2.2堿基類似物1.堿基類似物的誘變機制以5－溴尿嘧啶(5-BU)為例堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的堿基非常類似，因此能取代堿基摻入到DNA分子中的一類化合物。主要誘變劑：5-溴尿嘧啶（5-BU）/T2-氨基嘌呤（2-AP）/A35

G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUk

A:TA:BUk

A:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU摻入錯誤A:T→G≡C從上可知，由于5-BU分子結(jié)構(gòu)上的5位Br原子的存在，改變了電荷的分布，影響酮式和烯醇式的平衡。2.2堿基類似物2.堿基類似物的誘變處理方法(以5-BU為例)(1)單獨處理(2)與輻射線復(fù)合處理斜面細菌液體培養(yǎng)至對數(shù)期饑餓培養(yǎng)8-10h瓊脂平板涂布培養(yǎng)移接去培養(yǎng)液加生理鹽水加5-BU25-40μg/ml

據(jù)報道，如果菌體先用5-BU等堿基類似物進行處理，使它們首先滲入到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會比單獨使用輻射線更好。因此，堿基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑。真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度（0.1—1mg/ml），加到孢子懸液后，進行振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(一般6—12h)——分離于平皿——適溫培養(yǎng)——挑取單菌落，進行篩選。37

（a）亞硝酸（b）羥胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍改變堿基結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾劑：脫氨劑、羥化劑、烷化劑常見的堿基修飾劑2.3烷化劑烷化劑是誘發(fā)突變中一類相當有效的化學(xué)誘變劑，具有一個或多個活性烷基，易取代DNA分子中活潑的氫原子，與一個或多個堿基起烷化反應(yīng)，改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。雙功能烷化劑單功能烷化劑多功能烷化劑根據(jù)烷化劑中活性烷基的數(shù)目亞硝基類、磺酸酯類、硫酸酯類、重氮烷類、乙烯亞胺類化合物硫芥子、氮芥子類等1.烷化劑定義與種類烷化堿基部分烷化劑2.部分烷化劑和烷化堿基甲基磺酸甲酯亞硝基乙基脲7-甲基鳥嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鳥嘌呤2.3烷化劑2.3.1烷化劑1.烷化劑的作用機制(1)烷化劑主要通過烷化基團使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時導(dǎo)致堿基配對錯誤而引起突變。易發(fā)生烷化的位點：鳥嘌呤O6、胸腺嘧啶O4。其它位點：鳥嘌呤N3、腺嘌呤N2和N7

、胞嘧啶N3。(2)烷化劑還可引起DNA分子中磷酸和糖之間的共價鍵斷裂，而造成突變。2.3.1烷化劑(3)烷化劑還可能使兩個鳥嘌呤N7位點形成共價鍵。(4)一般雙功能烷化劑容易引起DNA雙鏈間的交聯(lián)，造成變異或死亡。1.烷化劑的作用機制2.3.1烷化劑2.烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生水解。見光容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，保藏時要注意避光。殺菌率低而誘變效應(yīng)高，如亞硝基類、磺酸酯類等。2.3.1烷化劑3.常用的烷化劑(1)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)超誘變劑之稱，能使細胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。酸堿條件影響NTG的誘變效果，配制NTG溶液和菌懸液都要用適宜的緩沖液，如磷酸或Tris緩沖液。pH<5.5，NTG分解成HNO2；pH>8.0，NTG分解產(chǎn)生重氮甲烷；pH=6.0，NTG本身和DNA起烷化作用。1.取新鮮的斜面，用一定pH值的緩沖液或Tris緩沖液洗下細菌制成菌懸液。如果采用細菌細胞或絲狀菌孢子（真菌或放線菌）須進行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時間控制在大部分孢子處在萌動階段，經(jīng)離心、洗滌，用緩沖液制成懸液，濃度約在106-107mL-1；NTG的誘變處理方法：2.3.1烷化劑3.常用的烷化劑(1)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為9：1（緩沖溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液濃度配成1mg/ml。使用時取母液0.2ml，加菌懸液1.8ml，NTG最后處理濃度為100μg/ml。一般處理濃度隨菌種不同而異，通常細菌為100—1000μg/ml，而放線菌、真菌孢子為1000—3000μg/ml。3.將以上菌懸液和NTG溶液混合于一試管內(nèi)，置該菌生長適宜的溫度下保溫處理若干時間。2.3.1烷化劑3.常用的烷化劑(1)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)4.終止反應(yīng)。用冷的生理鹽水稀釋到50倍以上或在低溫下進行離心洗滌，除去藥液，加無菌水使沉淀懸浮并作成一定稀釋度分離于平皿。處理完畢后，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡處理。除以上直接以溶液處理外，也可以進行如下方法誘變處理：1.搖瓶振蕩處理2.在平皿上生長過程處理2.3.1烷化劑3.常用的烷化劑(1)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)NTG是一種強烈的致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例如用自來水大量沖洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡過夜，洗凈。2.3.1烷化劑3.常用的烷化劑(1)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)2.3.1烷化劑(2)甲基磺酸乙酯(EMS)水溶液中水解半衰期短，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配；需低溫、干燥保存；誘變效應(yīng)最佳的酸堿條件為pH7.0～7.4；配制EMS和菌懸液需緩沖液，不僅影響誘變劑滲透到細胞內(nèi)的速度，還影響誘變劑的穩(wěn)定性。(3)硫酸二乙酯(DES)不溶于水，溶于乙醇，很不穩(wěn)定；水溶液中半衰期很短，隨用隨配，需低溫、干燥、避光保存；DES誘變效應(yīng)在pH中性時效應(yīng)最好。(4)乙烯亞氨溶于水，不穩(wěn)定易分解，易揮發(fā)，有強烈腐蝕作用，易燃易爆，需避光、密封、低溫保存；能與一個或多個堿基起化學(xué)反應(yīng)，引起DNA復(fù)制時堿基錯配而發(fā)生變異；在水溶液中易產(chǎn)生無誘變作用物質(zhì)，最好采用高濃度短時間處理。3.常用的烷化劑2.3.2脫氨劑(以亞硝酸為例)1.誘變機制脫氨基作用引起DNA兩條單鏈之間的交聯(lián)作用亞硝酸（nitrousacid）是典型的脫氨劑亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的DNA分子，脫去堿基中的氨基變成酮基，改變堿基氫鍵的電位，引起堿基轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。2.3.2脫氨劑(以亞硝酸為例)2.亞硝酸的處理方法(1)試劑配制1mol/LpH4.5醋酸緩沖液0.1mol/L亞硝酸鈉溶液0.07mol/LpH8.6磷酸氫二鈉溶液(2)處理方法處理對象亞硝酸鈉溶液處理濃度溫度處理時間終止反應(yīng)(加入磷酸氫二鈉溶液)孢子懸液0.025mol/L25～26℃10～20minpH降至6.8細菌懸液0.05mol/L35～37℃5～10minpH降至6.82.4移碼誘變劑移碼誘變劑與DNA相互結(jié)合引起堿基增添或缺失而造成突變。對噬菌體有較強的誘變作用；誘發(fā)細菌、放線菌的質(zhì)粒脫落比其他誘變劑效果更顯著。吖啶化合物的誘變機制：與DNA結(jié)合后，DNA鏈拉長，兩堿基距離拉寬，使堿基插入或缺失。吖啶黃的性質(zhì)和使用方法微溶于熱水，溶于乙醇和乙醚，不穩(wěn)定，需避光保存。2.5羥化劑羥胺（hydroxylamine）是典型的羥化劑羥胺的分子式為NH2OH（簡稱HA）,常以鹽酸羥胺形式存在（分子式為NH2OH·HCl），為白色晶體，溶于水，不穩(wěn)定易分解，具腐蝕性，容易吸濕，故要密封、干燥保存。羥胺是具有特異效應(yīng)的誘變劑，專一地誘發(fā)G:CA:T的轉(zhuǎn)換。2.5羥化劑羥胺的誘變機制改變了結(jié)構(gòu)的胞嘧啶2.5羥化劑

根據(jù)誘變機制，羥胺不能使突變回復(fù)，即不能使A:TG:C轉(zhuǎn)換，進行逆向突變。由于羥胺是誘發(fā)G:CA:T的專一性誘變劑，因此，可以用來鑒別突變體是A:TG:C還是G:CA:T轉(zhuǎn)換。羥胺的處理方法：常用濃度為0.1—5%，可直接在溶液中處理，時間1—2h，然后分離培養(yǎng)。但一般都加到瓊脂平板或振蕩培養(yǎng)基中，然后接入孢子或細菌，在適溫下培養(yǎng)，生長過程中處理，所用濃度比直接處理時低些。2.6金屬鹽類用于誘變育種的金屬鹽類主要有氯化鋰、硫酸錳等。氯化鋰單獨使用沒有明顯的誘變效果，幾乎都要與其他誘變劑配合處理，因此也稱為助誘變劑。它在高產(chǎn)菌種選育史上發(fā)揮了極其顯著的作用。2.7其他化學(xué)誘變劑1.秋水仙堿：是誘發(fā)細胞染色體多倍體的誘變劑。自1937年美國學(xué)者布萊克斯利（A.F.Blakeslee）等，用秋水仙素加倍曼陀羅等植物的染色體數(shù)獲得成功以后，秋水仙素就被廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)、遺傳學(xué)的研究和植物育種。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期，使具備兩套染色體的母細胞無法分裂，導(dǎo)致多倍體產(chǎn)生。2.抗生素：作為誘變劑的抗生素主要有鏈黑霉素，爭光霉素，絲裂霉素，放線菌素，正定霉素，光輝霉素和阿霉素等。都是抗癌藥物，效果不如烷化劑，應(yīng)用不廣泛。2.8重視化學(xué)誘變劑的操作安全誘變劑在DNA上的初級效應(yīng)遺傳反應(yīng)堿基類似物摻入作用AT?GC轉(zhuǎn)換羥胺同胞嘧啶起羥化反應(yīng)GC→AT轉(zhuǎn)換亞硝酸A、C的脫氧基作用DNA交聯(lián)AT→GC轉(zhuǎn)換缺失烷化劑烷化堿基（主要是G）而導(dǎo)致：脫嘌呤作用；烷化堿基的互變異構(gòu)作用；DNA鏈的交聯(lián)作用；糖-磷酸骨架的斷裂堿基置換（AT?GC轉(zhuǎn)換、AT→TA顛換、GC→CG顛換）及染色體畸變吖啶類個別堿基的插入或缺失移碼突變紫外線照射形成嘧啶二聚體；形成嘧啶的水合物；DNA交聯(lián)；DNA斷裂AT→GC轉(zhuǎn)換、AT→GC顛換、及移碼突變電離輻射脫氧核糖-堿基之間化學(xué)鍵及脫氧核糖-磷酸之間化學(xué)鍵的斷裂；通過自由基對DNA的作用AT?GC轉(zhuǎn)換、移碼突變及染色體畸變2.9小結(jié)第三節(jié)生物誘變劑噬菌體基因定點誘變劑生物誘變劑的主要誘變方式3.1噬菌體采用某些噬菌體來篩選抗噬菌體突變菌株時，常常發(fā)現(xiàn)伴隨著出現(xiàn)抗生素產(chǎn)量明顯提高的抗性突變株。因此，可以認為這些溶源性噬菌體是一種生物誘變劑。3.2基因定點誘變隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，點突變技術(shù)在蛋白質(zhì)工程中正得到