X312基因工程的基本操作程序課件

11.2基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1基因工程23基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定5編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游終止子啟動子與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)外顯子內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，有調(diào)控作用編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列6結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾成熟mRNA7關(guān)于內(nèi)含子和外顯子的說法正確的是（）A.內(nèi)含子和外顯子在轉(zhuǎn)錄的過程中都能夠轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA

B.只有外顯子能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA，tRNA，rRNA

C.原核細(xì)胞基因中也有內(nèi)含子和外顯子

D.由于內(nèi)含子不能編碼蛋白質(zhì)，故它屬于非編碼區(qū)B9基因文庫的分類按照外源DNA片段的來源：從特定組織提取的染色體基因組DNA --基因組DNA文庫（總）mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝--cDNA文庫（部分）基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。10基因組文庫部分基因文庫11基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因13模板DNA（已知堿基序列）特異性引物（DNA）耐熱DNA聚合酶（Taq酶）

dNTPs（4種脫氧核苷酸）Mg+(促進(jìn)dNTP與核酸骨架作用)PCR體系基本組成成分14PCR的基本反應(yīng)步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?C第三步：將反應(yīng)體系升溫至70～75℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA鏈延伸合成，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）加熱至90～95℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。第二步：將反應(yīng)體系降溫至55～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈配對結(jié)合，這個(gè)過程稱為復(fù)性。15模板DNA95℃5’3’3’5’5’3’3’5’變性1772℃5’3’3’5’5’5’Taq酶延伸11872℃5’3’3’5’5’5’延伸219Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402021模板DNA95℃22PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物23PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶25PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq26PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束29靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火30靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸31靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列32PCR是針對特定DNA片斷的快速體外復(fù)制增殖技術(shù)每循環(huán)一輪，目的基因的量可增加一倍增殖速率為2n,（n為循環(huán)次數(shù)）每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。33PCR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成

。

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部

。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的

。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈34從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法DNA合成儀DNA序列自動測序儀PCR擴(kuò)增儀35基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。36構(gòu)建表達(dá)載體組成目的基因啟動子終止子標(biāo)記基因目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。復(fù)制原點(diǎn)插入基因終止子抗生素抗性基因表達(dá)載體啟動子37將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法38將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）39將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2＋處理受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞，再進(jìn)行混合。將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性。40目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定41DNA分子雜交技術(shù)DNA-RNA分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交技術(shù)檢驗(yàn)受體細(xì)胞染色體的DNA上是否插入了目的基因檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠褶D(zhuǎn)錄出了mRNA檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠癖磉_(dá)出了蛋白質(zhì)個(gè)體生物學(xué)檢驗(yàn)個(gè)體生物學(xué)性狀觀察42DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報(bào)告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測SARS病毒等）abcd43①檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。②檢測是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原－抗體雜交，看是否有雜交帶。④還可以進(jìn)行個(gè)體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：①DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交；②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的。44大量的受體細(xì)胞接受不多的目的基因。處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物45歸納:

基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯461.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥473.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.

有關(guān)基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料485.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分A．啟動子B．終止密碼

C．標(biāo)記基因D．目的基因6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法

A．基因槍法B．顯微注射法

C．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法D．花粉管通道法49例、采用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)肷窖蚴芫眩嘤隽宿D(zhuǎn)基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。以下有關(guān)敘述，正確的是A.人體細(xì)胞中凝血因子基因編碼區(qū)的堿基對數(shù)目，等于凝血因子氨基酸數(shù)目的3倍B.可用顯微注射技術(shù)將含有人凝血因子基因的重組

DNA分子導(dǎo)入羊的受精卵C.在該轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺細(xì)胞，而不存在于其他細(xì)胞中D.人凝血因子基因開始轉(zhuǎn)錄后，DNA連接酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNAB50

胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計(jì)？

嘗試設(shè)計(jì)511.答：不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。思考與探究（P15）522.解析：農(nóng)桿菌可分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根瘤農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有93屬643種雙子葉植物對根瘤農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當(dāng)這些植物被該菌侵染后會誘發(fā)腫瘤。近年來，也有報(bào)道該菌對單子葉植物也有侵染能力。根瘤農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。近年來還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導(dǎo)作用。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。53需要注意的是農(nóng)桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，是需要加上述酚類物質(zhì)的，同時(shí)單子葉植物種類不同，農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有很大差異。如果想將一個(gè)抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點(diǎn)：①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。543.解析：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞