蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)公開(kāi)課課件

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）1.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究方法

(1)X-射線衍射法（X-raydiffractionmethod）(2)核磁共振（NMR）(3)光譜法（紅外光譜、紫外差光譜、熒光光譜）(4)旋光色散法（opticalrotatorydispersion,ORD）(5)園二色性（circulardichroism,CD）(6)氫同位素交換法2X-射線衍射法簡(jiǎn)單原理3早在20世紀(jì)30年代，Pauling和Corey就開(kāi)始有X-射線衍射方法研究了氨基酸和肽的結(jié)構(gòu)，他們得到了重要的結(jié)論:(1)肽鍵的鍵長(zhǎng)介于C-N單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。

(2)肽鍵中的四個(gè)原子和它相鄰的兩個(gè)α-碳原子處于同一平面，形成了酰胺平面，也稱肽鍵平面。(3)在酰胺平面中C=0與N-H呈反式。

56多肽鏈的主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以α碳原子相隔。而Cα-C鍵和Cα-N鍵是單鍵，可以自由旋轉(zhuǎn)，其中Cα-C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ，Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ。ψ和φ這一對(duì)兩面角決定了相鄰兩個(gè)酰胺平面的相對(duì)位置，也就決定了肽鏈的構(gòu)象。7①蛋白質(zhì)多肽鏈像螺旋一樣盤曲上升，每3.6個(gè)氨基酸殘基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度為0.54nm，每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，螺旋上升時(shí)，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100o。

②在同一肽鏈內(nèi)相鄰的螺圈之間形成氫鏈。

③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白質(zhì)絕大部分是右手螺旋，到目前為止僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋。

α-螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)如下：

α-螺旋的穩(wěn)定性主要靠氫鍵來(lái)維持。9除了上面這種典型的α-螺旋外，還有一些不典型的α-螺旋，所以規(guī)定了有關(guān)螺旋的寫(xiě)法，用“nS”來(lái)表示，n為螺旋上升一圈氨基酸的殘基數(shù)。S為氫鍵封閉環(huán)內(nèi)的原子數(shù)，典型的α-螺旋用3.613表示，非典型的α-螺旋有3.010，4.416（π螺旋）等。1011(2)β-折疊也是pauling等人提出來(lái)的，它是與α-螺旋完全不同的一種結(jié)構(gòu)。①β-折疊主鏈骨架以一定的折疊形式形成一個(gè)折疊的片層。②在兩條相鄰的肽鏈之間形成氫鏈。13③β-折疊有平行和反平行的兩種形式:④每一個(gè)氨基酸在主軸上所占的距離，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm。14(3)β-轉(zhuǎn)角

(β-turn)β-轉(zhuǎn)角是指蛋白質(zhì)的分子的多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180o的回折，在回折角上的結(jié)構(gòu)就稱β-轉(zhuǎn)角，也稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或稱U形轉(zhuǎn)折。由第一個(gè)氨基酸殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N—H之間形成氫鍵。15(5)Ω環(huán)這是最近發(fā)現(xiàn)普通存在于球狀蛋白質(zhì)中的一種新的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的形狀象希臘字Ω，所以稱Ω環(huán)。Ω環(huán)這種結(jié)構(gòu)總是出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的表面，而且以親水殘基為主，這種結(jié)構(gòu)與生物功能有關(guān)，另外在分子識(shí)別中可能起重要作用。173.蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

超二級(jí)結(jié)構(gòu)是1973年Rossmann提出的，它是指二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位（α-螺旋，β-折疊等）相互聚集，形成有規(guī)律的二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚集體。已知的超二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有αα，βxβ，β-曲折和β-折疊筒等。18αα：是兩個(gè)α-螺旋互相纏繞，形成一個(gè)左手超螺旋。19如χ為β-折疊，則為βββ。如x為無(wú)規(guī)卷曲，則為βcβ。21β-曲折（β-meander）：是三條或三條以上反平行的β-折疊通過(guò)短鏈，如β-轉(zhuǎn)角相連。22β-折疊筒（β-sheatbarrel）：由多條β-折疊鏈所構(gòu)成的β-折疊片，再卷成一個(gè)園筒狀的結(jié)構(gòu)。23

結(jié)構(gòu)域是1970年Edelman提出的，它是指在較大的球狀蛋白質(zhì)分子中，多肽鏈往往形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此分開(kāi)，以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象就是結(jié)構(gòu)域。

最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)域約含100～200個(gè)氨基酸殘基，少至40個(gè)左右，多至400個(gè)以上。

結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位，多肽鏈折疊的最后一步是結(jié)構(gòu)域的締合。25對(duì)那些較小的蛋白質(zhì)分子來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是一個(gè)意思，也就是說(shuō)是單結(jié)構(gòu)域的。一般來(lái)說(shuō)，大的蛋白質(zhì)分子可以由2個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。26下面以鯨肌紅蛋白為例，說(shuō)明蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，1963年Kendrew等通過(guò)鯨肌紅蛋白的x-射線衍射分析，測(cè)得了它的空間結(jié)構(gòu)。29肌紅蛋白是由一條多肽鏈折疊盤繞成近似球狀的構(gòu)象。(2)主鏈的80%左右是右手螺旋，其余為無(wú)規(guī)卷曲，一條多肽鏈共有8個(gè)螺旋區(qū)（A、B、C、D、E、F、G、H），7個(gè)非螺旋區(qū)（二個(gè)在末端，中間有五個(gè)）。(3)氨基酸殘基的親水基團(tuán)幾乎全部分布在分子的表面，而疏水基團(tuán)幾乎全部在分子的內(nèi)部。(4)血紅素輔基垂直地伸出分子表面，通過(guò)一個(gè)His殘基和分子內(nèi)部相連。30從目前對(duì)球狀蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)研究的資料來(lái)看，它們有一些共同的特點(diǎn)：(1)在球狀蛋白質(zhì)分子中,一條多肽鏈往往通過(guò)一部分α-螺旋，一部分β-折疊，一部分β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲等使肽鏈折疊盤繞成近似球狀的構(gòu)象。(2)球狀蛋白質(zhì)的大多數(shù)極性側(cè)鏈總是暴露在分子表面形成親水面，而大多數(shù)非極性側(cè)鏈總是埋在分子內(nèi)部形成疏水核。(3)球狀蛋白質(zhì)的表面往往有內(nèi)陷的空穴，空穴周圍有許多疏水側(cè)鏈，是疏水區(qū)，這空穴往往是酶的活性部位或蛋白質(zhì)的功能部位。315.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)

四級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)的亞基聚合成大分子蛋白質(zhì)的方式（亞基是指一條多肽鏈或以共價(jià)鏈連接在一起的幾條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子的最小共價(jià)結(jié)構(gòu)單位）。亞基與肽鏈32一般來(lái)說(shuō)亞基不具有生物活性，即使有也很小，只有當(dāng)這些亞基聚合成一個(gè)完整的蛋白質(zhì)分子后，才具有生物活性。33血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的確定要?dú)w功于英國(guó)科學(xué)家Max.Perutz34下面以血紅蛋白（hemoglobin）為例，說(shuō)明蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，血紅蛋白是由四個(gè)亞基組成，2個(gè)α-亞基，2個(gè)β-亞基，每個(gè)亞基由一條多肽鏈與一個(gè)血紅素輔基組成。４個(gè)亞基以正四面體的方式排列，彼此之間以非共價(jià)鍵相連（主要是離子鍵、氫鍵）

。356．纖維狀蛋白質(zhì)的構(gòu)象

（1）角蛋白（keratin）α-角蛋白36（2）絲心蛋白（也稱絲蛋白，fibroin）37（3）膠原蛋白（collagen）387.維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵

維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華引力二硫鍵、配位鍵39

疏水鍵二硫鍵氫鍵離子鍵范德華引力配位鍵40a離子鍵b氫鍵c疏水鍵d范德華引力41六、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似，但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過(guò)肽鍵形成了大分子化合物，也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。42（一）膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子很大，在水中形成膠體溶液。蛋白質(zhì)主要是指球狀蛋白質(zhì)有親水面，它的親水基團(tuán)都在表面，因此與水有很大的親和力，成為親水膠體。蛋白質(zhì)的親水膠體溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的，一方面由于蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)會(huì)吸引它周圍的水分子，使水分子定向排列在它的周圍，形成“水化層”。另一方面由于蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)帶有同種電荷，同種電荷相斥，也使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不會(huì)聚合。43（二）酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn)1.蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán)2.等電點(diǎn)在某一pH值時(shí)，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH值就是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

44每種蛋白質(zhì)都有它特有的等電點(diǎn)，這也是鑒別蛋白質(zhì)的指標(biāo)之一。蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點(diǎn)的關(guān)系:等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類有關(guān)。453.等離子點(diǎn)

等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)在不含其它溶質(zhì)的純水中，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零時(shí)的溶液的pH值。等離子點(diǎn)是一個(gè)常數(shù)。464．蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定等電聚焦47（三）電泳移動(dòng)的速度v=E·Zf48(四)變性作用（denaturation）

1．變性的概念和理論概念：變性是指蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變以及生物活性的喪失。理論：吳憲提出肽鏈從緊密有序結(jié)構(gòu)→松散無(wú)序的結(jié)構(gòu)492．變性的因素物理因素:加熱、紫外線、X-射線、超聲波等?；瘜W(xué)因素:酸、堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑（尿素、鹽酸胍）、重金屬鹽等。503．變性蛋白質(zhì)的特性（1）生物活性全部或部分喪失（2）一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露，可滴定基團(tuán)增加（3）一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變（4）生化性質(zhì)的改變514．變性的可逆性52蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)53（五）凝固作用變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的凝固。54（六）沉淀作用

1．加酸沉淀蛋白質(zhì)2．加中性鹽沉淀蛋白質(zhì)3．加有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)4．加重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)5．加生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)55（七）沉降作用

什么是沉降？沉降速度：指離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子在單位時(shí)間內(nèi)下沉的距離。t：時(shí)間（sec）x：下沉的距離（cm）v=dxdt沉降常數(shù)（沉降系數(shù)）：當(dāng)沉降界面以恒速移動(dòng)時(shí)，單位離心場(chǎng)中的沉降速度。s：沉降常數(shù)v：沉降速度（cm/sec）w：離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的角速度（弧度/sec）x：蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)離旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm計(jì)。瑞典的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.Svedberg1S=10-13秒。56（一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1．鐮刀狀紅細(xì)胞貧血?。╯ickle-cellanemia）七、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

5758ObservedNormalrangeRedcellcount2.6×106/ml4.6～6.2×106/mlHemoglobincontent8g/100ml14～18g/100mlWhitecellcount15,250/ml4,000～10,000/ml59HbA（adulthemoglobin）HbS（sickle-cellhemoglobin）

601954年 指紋圖譜（fingerprint）6162HbAβ-鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…HbSβ-鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…636465662．激素和它的前體分子胰島素和它的前體676869

（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)為例說(shuō)明蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系701．血紅蛋白中血紅素輔基的結(jié)構(gòu)712．血紅素中的Fe2+與氧結(jié)合前后價(jià)數(shù)不變723．血紅蛋白與氧的結(jié)合734．血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)(變構(gòu)效應(yīng))（allostericeffect）7475氧合作用顯著改變Hb的四級(jí)結(jié)構(gòu)，血紅素鐵的微小移動(dòng)導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換（從T態(tài)→R態(tài)）T態(tài)（tensestate）緊張態(tài) R態(tài)（relaxedstate）松馳態(tài)。76血紅蛋白是由兩個(gè)α-亞基和兩個(gè)β-亞基組成的四聚體（α2β2），有穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)，與氧的親和力很弱，但當(dāng)氧與血紅蛋白分子中一個(gè)亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后。即引起該亞基構(gòu)象的改變，一個(gè)亞基構(gòu)象的改變又會(huì)引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變，亞基間的次級(jí)鍵被破壞，結(jié)果整個(gè)分子從緊密的構(gòu)象變成比較松散的構(gòu)象，易于與氧結(jié)合，使血紅蛋白與氧結(jié)合的速度大大加快。77別構(gòu)效應(yīng)是指含亞基的蛋白質(zhì)分子由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基以至整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生變化。785．波耳（Bohr）效應(yīng)H+和CO2促進(jìn)HbO2釋放O2

79806.2，3一二磷酸甘油酸對(duì)Hb氧合的影響Or2,3-Bisphosphoglycerate(BPG)818283八、蛋白質(zhì)的分離、純化和鑒定一般包括五步（一）細(xì)胞破碎

有機(jī)械方法如高速組織搗碎器、玻璃勻漿器、在研缽中或球磨機(jī)上磨等。還有超聲法、反復(fù)凍融法、自溶等方法。84（二）抽提

根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性用適當(dāng)溶劑來(lái)抽提，總的原則是要制備的蛋白質(zhì)溶在什么溶劑中就用什么溶劑來(lái)抽提。85（三）分離

1．鹽析法在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，常用的中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等。

862．有機(jī)溶劑沉淀法常用的是乙醇、丙酮。873．等電點(diǎn)沉淀利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小這一特性，可以調(diào)溶液的pH，盡量接近它的等電

點(diǎn)，而使蛋白質(zhì)沉淀。884．吸附法吸附法是利用各種吸附劑和蛋白質(zhì)結(jié)合能力（吸附能力）的不同來(lái)分離蛋白質(zhì)。895．透析和超濾超濾法是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，利用分子大小不同，來(lái)分離蛋白質(zhì)。透析90（四）純化1．離子交換層析離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。常用的陽(yáng)離子交換劑為羧甲基纖維素（CM-C），陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C）。91922．凝膠過(guò)濾也稱分子排阻層析、分子篩層析，這是