研究生專業(yè)技能訓(xùn)練唐雪

基因表達(dá)(GeneExpression)

細(xì)胞在生命過(guò)程中，把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是同相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因編碼的。

對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)即為基因表達(dá)調(diào)控(RegulationofGeneExpressionorGeneControl)。

①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控；

②mRNA加工、成熟水平上的調(diào)控；

③翻譯水平上的調(diào)控

Gene(DNA)TranscriptionmRNAProteinCellularFunctionTranslation第一頁(yè)，共34頁(yè)。mRNA每一個(gè)真核細(xì)胞約含5-10μgRNA80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA）10-15%tRNA和核內(nèi)小分子RNA1-5%的mRNA

分子量不均一3′末端有polyA組成的尾，利用寡聚（dT）親和層析柱分離提取高純度完整的RNA，是研究基因表達(dá)、體外轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、RT-PCR、Northern雜交的重要基礎(chǔ)環(huán)節(jié)第二頁(yè)，共34頁(yè)。實(shí)驗(yàn)安排第一次課（全天）實(shí)驗(yàn)一小鼠肝臟總RNA提?。ㄉ衔纾?shí)驗(yàn)二PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性DNA片段（一）（下午）第二次課實(shí)驗(yàn)二PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性DNA片段（二）第三頁(yè)，共34頁(yè)。實(shí)驗(yàn)一小鼠總RNA提取TRIzol法TRIzol中含有RNase抑制劑（異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉）增強(qiáng)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白分離在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)蛋白和DNA的水相中，容易被異丙醇沉淀異丙醇使RNA沉淀濃縮第四頁(yè)，共34頁(yè)。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵：嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套（使用一次性手套）、口罩操作所用的玻璃器皿、塑料容器等均需進(jìn)行處理后方可使用（詳見注意事項(xiàng)）實(shí)驗(yàn)所用試劑可用含有0.1%DEPC121℃高壓滅菌處理后的水配置第五頁(yè)，共34頁(yè)。實(shí)驗(yàn)步驟1.動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前禁食8-10小時(shí)。取100mg新鮮肝組織加1mLTRizol（預(yù)冷）試劑，

于冰浴勻漿，勻漿速度要快，使肝組織迅速接觸到變性劑，避免組織內(nèi)源RNA

酶的污染。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫靜置10min；

注意：高蛋白，脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12000離心10min去掉不溶物，再進(jìn)行后面操作。2.加入200uL（或1/5體積）氯仿，充分混合30s，室溫靜置5min，分層。4℃12000rpm離心15min，離心管中液體分為3層：上層為水相，RNA在此

相中，蛋白質(zhì)在下層黃色的有機(jī)相中，DNA保留在上下兩層的界面處的中間層；3.小心吸取上層水相約0.4mL（或<0.4mL）于新的塑料離心管中（切勿吸取中

間層和下層液體）。加入等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置

20min（或-20℃靜置30min以上）；第六頁(yè)，共34頁(yè)。4.4℃12000rpm離心15min，沉淀RNA，棄上清；5.用1mL預(yù)冷的75%乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀，12000rpm4℃離心10min，棄盡上清；6.重復(fù)步驟5，然后室溫中自然干燥約10min，至RNA呈半透明狀即可(用10μl槍小心吸取多余乙醇)；7.根據(jù)RNA提取量加20-100μLDEPC（50μL）處理的水溶解沉淀，56℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液；8.如須保存，可加0.1體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.2倍體積的冰無(wú)水乙醇，充分混勻，于-70℃低溫保存。或用穩(wěn)定的甲酰胺溶（4mg/mL）,-20℃保存，用時(shí)，4倍乙醇沉淀，回收RNA。第七頁(yè)，共34頁(yè)。RNA純度、濃度測(cè)定及分子完整性的鑒定RNA是否能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，取決于它的純度和分子的完整性，常用的鑒定方法是測(cè)定樣品260nm與280nm的光吸收值以及電泳顯示RNA分子是否降解。1.260nm/280nm光吸收比值取10μL總RNA樣品，加990μLDEPC水（配2mL），混勻，測(cè)同一樣品在260nm和280nm光吸收值（A260和A280）2.計(jì)算

RNA純度=A260/A280

比值范圍<1.8，RNA樣品有蛋白質(zhì)或酚（苯環(huán)物質(zhì)）污染，需要用氯仿重新抽提。>2.0，核苷酸降解

RNA濃度（μg/mL）=A260×40×（1/光徑）×稀釋倍數(shù)（100倍）

提取的RNA濃度約1-5μg/μL為宜第八頁(yè)，共34頁(yè)。RNA電泳（甲醛變性凝膠電泳）RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測(cè)中最重要的步驟第九頁(yè)，共34頁(yè)。用途:

檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平檢測(cè)基因表達(dá)細(xì)胞中RNA病毒的含量直接克隆特定基因的cDNA序列注意問(wèn)題：mRNAcDNAOligodT,逆轉(zhuǎn)錄酶特異性引物,Taq酶PCRRNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)模板RNA：總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)二PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性DNA片段(RT-PCR)第十頁(yè)，共34頁(yè)。適用于mRNA表達(dá)量解析?TwoStepRT--PCR效率高?使用Random和Oligo--dT引物可以制備cDNApool?cDNA可長(zhǎng)期保存TwoStepRT--PCR第十一頁(yè)，共34頁(yè)。1.逆轉(zhuǎn)錄(RT)第一步（10μL）RNA(1ug/uL)2uLdNTP(10mM)2uLOligo(0.5ug/uL)2uLDEPC水4uL①70℃,5min②4℃5×buffer5uLRnaseI(40u/uL)0.2uLM-MLV(200u/uL)0.5uLDEPC水9.3uL①37℃,1h②95℃,5min③4℃(或-20℃長(zhǎng)期保存)第二步（15μL）第十二頁(yè)，共34頁(yè)。1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸③高溫變性①低溫退火②重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2.PCR第十三頁(yè)，共34頁(yè)。text1tex2text3標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×擴(kuò)增緩沖液H2O第十四頁(yè)，共34頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃第十五頁(yè)，共34頁(yè)。50℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)56℃引物1引物2DNA引物第十六頁(yè)，共34頁(yè)。72℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶第十七頁(yè)，共34頁(yè)。95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)94℃第1輪結(jié)束第2輪開始第十八頁(yè)，共34頁(yè)。56℃72℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃TaqTaqTaqTaq第十九頁(yè)，共34頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第二十頁(yè)，共34頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增第二十一頁(yè)，共34頁(yè)。PCR產(chǎn)物生成曲線log[DNA]Cycles第二十二頁(yè)，共34頁(yè)。PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時(shí)第二十三頁(yè)，共34頁(yè)。2.基因擴(kuò)增（β-actin）5×buffer2.5uLdNTP（2.5mM）2uLMg2+1.5uL上游引物

（10pM）2uL下游引物(10pM)2uLcDNA2uLTaq酶（4u/uL）0.1uLH2O

13.4uL34Cycle94℃5min,

94℃30s,55℃30s,72℃1min,72℃10min,4℃

34循環(huán)第二十四頁(yè)，共34頁(yè)。PCR具有極高的靈敏度樣品正對(duì)照負(fù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問(wèn)題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增過(guò)某個(gè)片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對(duì)不要忘了負(fù)對(duì)照。用紫外燈破壞污染物也是一個(gè)辦法第二十五頁(yè)，共34頁(yè)。text1text2text3不同樣品有不同的生成曲線log[DNA]Cycles第二十六頁(yè)，共34頁(yè)。舉例內(nèi)參選定，共同擴(kuò)增第二十七頁(yè)，共34頁(yè)。－原理：

PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR整個(gè)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析

Ct值2.Real-TimePCR（實(shí)時(shí)定量）－用途：組織的基因表達(dá)分析，應(yīng)用非常廣泛－優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)第二十八頁(yè)，共34頁(yè)。Cycle1Cycle3Cycle2SYBRgreen①SYBRgreen作用原理MolecularProbe公司的一個(gè)專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134,1993年7月12日申請(qǐng)第二十九頁(yè)，共34頁(yè)。SYBRgreen的優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)便可以使用已有的引物普遍通用可以檢測(cè)所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體需要化大力氣優(yōu)化反應(yīng)條件，以消除非特異性擴(kuò)增價(jià)格$1/PCR反應(yīng)定量的靈敏度有所欠缺第三十頁(yè)，共34頁(yè)。②TaqMan體系A(chǔ)BI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,1995年11月申請(qǐng)。實(shí)時(shí)檢測(cè):

每個(gè)循環(huán)都會(huì)產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì)第三十一頁(yè)，共