綠色銀光蛋白課件

“綠色熒光蛋白”讓未知世界顯影Osamu

Shimomura

Martin

Chalfie

Roger

Y.

Tsien

（錢(qián)永健）2008年10月8日，美Woods

Hole海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的下村修、哥倫比亞大學(xué)的馬丁-沙爾菲和加州大學(xué)圣地亞哥分校的錢(qián)永健三位美國(guó)科學(xué)家，因?yàn)樵谒钢邪l(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白而獲得2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

GFP發(fā)現(xiàn)之旅；1962年，下村修首次從維多利亞多管水母Aequorea

victoria中分離出GFP。他發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線(xiàn)下會(huì)發(fā)出明亮的綠光。

1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并測(cè)定了水母中綠色熒光蛋白的基因。1993年，Martin

Chalfie證明了GFP作為多種生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標(biāo)記的價(jià)值。在最初的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，他用GFP使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的6個(gè)單獨(dú)細(xì)胞有了顏色。

1994年，錢(qián)永健開(kāi)始改造熒光蛋白，培育出黃色、藍(lán)色、綠色、紅色等多種顏色的熒光蛋白，理解了GFP發(fā)出熒光的機(jī)制。世界上目前使用的熒光蛋白大多是錢(qián)永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種。令在同一時(shí)間跟蹤多個(gè)不同的生物學(xué)過(guò)程成為現(xiàn)實(shí)。錢(qián)永健還開(kāi)發(fā)了檢測(cè)熒光蛋白的熒光探針技術(shù)。GFP簡(jiǎn)介維多利亞多管水母生活在北太平洋寒冷水域。這種水母體內(nèi)含有一種生物發(fā)光蛋白質(zhì)——aequorin，它本身發(fā)藍(lán)光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當(dāng)水母容光煥發(fā)的時(shí)候我們實(shí)際看到的顏色。GFP的純?nèi)芤涸诘湫偷氖夜庀鲁庶S色，但是當(dāng)被拿到戶(hù)外的陽(yáng)光下時(shí)，它會(huì)發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質(zhì)從陽(yáng)光中吸收紫外光，然后以能量較低的綠光形式發(fā)射出來(lái)。GFP結(jié)構(gòu)蛋白序列SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIGFP由238個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為26.9kDa。GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,蛋白質(zhì)中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu),長(zhǎng)420nm,寬240nm,由11個(gè)β片層組成桶狀構(gòu)成疏水中心和由4個(gè)α螺旋以及其中一個(gè)α螺旋包含著的發(fā)光基團(tuán)構(gòu)成。

GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)桶的頂部由3個(gè)短的垂直片段覆蓋,底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋,對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。嚴(yán)密的桶形結(jié)構(gòu)保護(hù)著熒光基團(tuán)，防止它被周?chē)h(huán)境淬滅。實(shí)驗(yàn)表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性,去除N端6個(gè)氨基酸或C端9個(gè)氨基酸,GFP均會(huì)失去熒光。這是由于生色團(tuán)形成的效率較低,而且形成過(guò)程受外界環(huán)境影響較大的緣故GFP獨(dú)特的結(jié)構(gòu)由238個(gè)氨基酸組成“像一個(gè)罐頭”每個(gè)單體由11個(gè)反向平行的-sheets圍繞，4個(gè)-helix組成，其中一個(gè)-helix位于“罐頭”內(nèi)大約長(zhǎng)420nm,寬240nm熒光基團(tuán)位于核心的-helixGFP結(jié)構(gòu)由α螺旋含有發(fā)光基團(tuán)由第65、66、67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)構(gòu)成。翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,在O2存在下,分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后,導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這樣,GFP分子中形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán),該過(guò)程可以自動(dòng)催化完成。1.兩個(gè)野生型GFP吸收紫外光和藍(lán)光，發(fā)射綠光，在395nm出現(xiàn)一個(gè)最大吸收峰,在470nm出現(xiàn)一個(gè)小的吸收。出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰的原因可能是由于存在陰性和中性?xún)蓚€(gè)不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的生色團(tuán)。由于存在兩個(gè)吸收峰,野生型GFP可以被標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)波紫外源和異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)所激發(fā)。GFP性質(zhì)2.能夠在單獨(dú)或者與其它蛋白融合時(shí)產(chǎn)生熒光。而其最顯著的特點(diǎn)是除了氧氣之外，不需要其他輔酶，不需底物。3.Baird等研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然GFP有緊密的桶狀結(jié)構(gòu)和形成發(fā)光基團(tuán)所必需的復(fù)雜的翻譯后修飾，當(dāng)對(duì)GFP的N端和C端部分交換重排并以一段間隔重新連接時(shí)，GFP仍然具有熒光。并且，GFP的某些位點(diǎn)可以耐受整段蛋白的插入，在結(jié)合金屬離子的黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein,YFP，GFP的突變體）中145位插入鋅指結(jié)構(gòu)能使熒光強(qiáng)度多倍提高。4.GFP作為報(bào)告分子具有很多優(yōu)點(diǎn)，如實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和定位、熒光為蛋白的內(nèi)在屬性、熒光發(fā)射無(wú)種屬依賴(lài)性、熒光信號(hào)對(duì)光漂白具有高抗性、檢測(cè)時(shí)不需要附加輔助因子、在細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)無(wú)明顯毒性、具有高度穩(wěn)定性。另外，細(xì)胞內(nèi)GFP的檢測(cè)也比較簡(jiǎn)單，如利用紫外燈、熒光顯微鏡、熒光激活細(xì)胞分選儀等，現(xiàn)有報(bào)道利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行GFP熒光定量測(cè)定的方法。熒光互補(bǔ)不僅僅在蛋白質(zhì)相互作用中有所應(yīng)用，Jeong等研究人員以與底物結(jié)合時(shí)會(huì)有典型的構(gòu)象變化麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）為模型，將MBPC端和N端分別與GFP片斷融合。結(jié)果證明加入底物的一組顯示出比對(duì)照組更強(qiáng)的熒光，由此提出split-GFP在觀察蛋白構(gòu)型變化中的應(yīng)用。另外，一種重要的熒光成像技術(shù)—熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）也被廣泛應(yīng)用。它能夠利用GFP及其突變體青色熒光蛋白（CFP）、黃色熒光蛋白（YFP）等，定時(shí)、定量、定位、無(wú)損傷地在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)大分子構(gòu)象變化、蛋白之間相互作用、信號(hào)傳遞途徑。2.GFP在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn),某些突變的GFP能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），F(xiàn)RET對(duì)于兩個(gè)熒光分子相互間的定位和距離高度敏感(在納米范圍內(nèi))。兩個(gè)分子間微小的線(xiàn)性或空間定位關(guān)系的破壞可以強(qiáng)烈地改變能量轉(zhuǎn)移的效率。通過(guò)計(jì)算供應(yīng)分子對(duì)于接受分子熒光釋放的比率來(lái)觀測(cè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的指標(biāo)。它消除了GFP分子在絕對(duì)濃度、細(xì)胞的厚度、激發(fā)源的能量度以及檢測(cè)的絕對(duì)效率等的影響。利用FRET可以作成GFP依賴(lài)的生物探針,現(xiàn)已有研究人員設(shè)計(jì)大分子或分子配對(duì)物來(lái)改變GFP之間原有生理信號(hào)反應(yīng)的FRET。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,研究人員設(shè)計(jì)了FRET依賴(lài)的Ca2+敏感指示劑,該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過(guò)改變兩個(gè)GFP之間的距離,可增加FRET。另有一些研究人員,并沒(méi)有把兩個(gè)GFP融合在一個(gè)單一結(jié)構(gòu)中,而是把一個(gè)GFP融合到CaM上,另一個(gè)GFP融合到CaM結(jié)合區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)Ca2+結(jié)合到CaM上,出現(xiàn)分子間異源二聚體,兩個(gè)GFP足夠接近而產(chǎn)生FRET。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示了FRET不僅可以在分子內(nèi)發(fā)生,而且還可在分子間發(fā)生。GFP的結(jié)構(gòu)雖然具有高度完整性,但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在GFP中某些確定的位置,插入外源基因,完全沒(méi)有喪失其熒光性。當(dāng)把CaM插入黃色熒光GFP突變體中,得到Ca2+傳感器,當(dāng)Ca2+結(jié)合到CaM上,導(dǎo)致生色團(tuán)去質(zhì)子化,使熒光強(qiáng)度增加7倍。當(dāng)在黃色熒光GFP中插入一個(gè)Zif268鋅指結(jié)構(gòu),可以得到傳導(dǎo)Zn2+的GFP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光少量增加,為改變前的1.7倍,Kd值約0.4mmol。插入外源基因致使GFP熒光敏感性增強(qiáng)的現(xiàn)象,提供了一個(gè)獲取永久編碼傳感器去監(jiān)測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新路徑。改進(jìn)GFP的應(yīng)用前景

藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，褐色。。。。。。1.提高了GFP的光譜性質(zhì)，2.提高熒光強(qiáng)度3.提高光穩(wěn)定性4.顏色突變5.pH敏感的突變體

應(yīng)用GFP研究成果美新奧爾良科學(xué)家培育出世界首只能在“黑暗處發(fā)光”的貓

杰夫·利希曼利用熒光蛋白展現(xiàn)了大腦內(nèi)的連接，圖片中美麗的“彩虹”就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)

1997年在大阪大學(xué)降生的第一種發(fā)光哺乳動(dòng)物小老鼠兩只熒光豬誕生于中國(guó)黑龍江省哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室

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