第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法1

顯微鏡---細(xì)胞學(xué)說(shuō)電子顯微鏡與分子生物學(xué)結(jié)合，細(xì)胞生物學(xué)才能有今天的發(fā)展。結(jié)構(gòu)與功能（動(dòng)態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動(dòng)；實(shí)驗(yàn)科學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)——細(xì)胞真知源于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)最早的光學(xué)顯微鏡是1590年Janssen和他的侄子共同研制的。其后，RobertHooke和Leeuwenhoek對(duì)光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)進(jìn)行了極大的改進(jìn)，由此發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞。20世紀(jì)30年代發(fā)展起來(lái)的電子顯微鏡導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)生了一次革命，使生物學(xué)家得以從亞顯微水平上重新認(rèn)識(shí)細(xì)胞。現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四光學(xué)和電子顯微鏡成像原理不管是何種顯微鏡，鏡像的形成都需要三個(gè)基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四透射現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四●焦距與角孔徑焦距(focallength)是透鏡的中心平面到焦點(diǎn)的距離，而角孔徑(angularaperture)是光從樣品進(jìn)入顯微鏡的物鏡半角α，因此角孔徑實(shí)際表示有多少光離開(kāi)樣品通過(guò)透鏡?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四角孔徑越大，透過(guò)透鏡的信息越多現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四分辨率:透鏡最重要的性質(zhì)就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式計(jì)算:R=0.61λ/nSinα其中:n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對(duì)物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長(zhǎng)。0.61是一個(gè)恒定的參數(shù)，表示成像的點(diǎn)雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度。從上式可知，角孔徑越大，進(jìn)入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能夠區(qū)別兩個(gè)點(diǎn)間最近距離的能力，所以R值越小，分辨率越高。從分辨率的表達(dá)式來(lái)看，或者波長(zhǎng)越短，分辨率越高。

現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四分辨極限(limitresolution)與放大率(magnification)對(duì)可見(jiàn)光來(lái)說(shuō)，能清楚地分辨出相鄰兩點(diǎn)之間的最小間隔是0.2μm，稱之為分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率?？偡糯舐?/p>

=物鏡放大率×目鏡放大率，放大率同樣受分辨極限的限制。一般來(lái)說(shuō)，光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。由于透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是，所以光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時(shí)最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為1400倍。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四增大角孔徑或縮短波長(zhǎng)可提高光學(xué)顯微鏡的分辨率。如果用波長(zhǎng)比普通波長(zhǎng)短得多的電子波代替光波，分辨率可大大提高，電子顯微鏡就是在這種需求下被發(fā)明的。表電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空光學(xué)顯微鏡300nm可見(jiàn)光玻璃透鏡不需真空200nm(油鏡)可見(jiàn)光玻璃透鏡不需真空100nm紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四1、

常用的光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)是光學(xué)顯微技術(shù)的主要工具，自問(wèn)世以來(lái)已有400多年歷史。光學(xué)顯微鏡是利用光線照明，使微小物體形成放大影像的儀器?，F(xiàn)今使用的光學(xué)顯微鏡都是由幾個(gè)透鏡組合而成，所以又稱為復(fù)合顯微鏡?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四普通雙筒顯微鏡比較高級(jí)的顯微鏡上都設(shè)有傾斜式的雙目鏡筒。在物鏡轉(zhuǎn)換器上方裝有四個(gè)棱鏡，使經(jīng)過(guò)物鏡的光線平分為兩路到達(dá)目鏡，故雙筒顯微鏡的亮度要比單筒者為暗。雙筒顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)用兩眼觀察，有較強(qiáng)的立體感?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四石蠟切片技術(shù)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）熒光顯微鏡的工作原理是利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源，通過(guò)照明設(shè)備把顯微固定的切片或活染的細(xì)胞透視出來(lái)?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四熒光顯微鏡原理現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四

相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計(jì)，尤其是光學(xué)系統(tǒng)有很大的不同，可用于觀察未染色的活細(xì)胞。相差顯微鏡是能將物體本身的相位差轉(zhuǎn)換為振幅差的顯微鏡。在普通光鏡下觀察標(biāo)本時(shí)，是靠顏色（波長(zhǎng)）和亮度（振幅）的差別而看到被檢物體的結(jié)構(gòu)，而活細(xì)胞近于無(wú)色透明，光波通過(guò)不吸收光，振幅變化不大，故人眼感覺(jué)不到，為解決這一難題，30年代（1934—1935）荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計(jì)制造出相差顯微鏡，并用此而獲1953年諾貝爾獎(jiǎng)。

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四相差顯微鏡的光學(xué)部件及光線通路現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四相差顯微鏡觀察的活細(xì)胞現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四■暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器使照明光線不能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四暗視野顯微鏡的光學(xué)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成與普通顯微鏡一樣，所不同的只是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過(guò)來(lái)。前者置于載物臺(tái)之下，而后者在載物臺(tái)的上方。集光器與載物臺(tái)之間的工作距離提高。可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察?，F(xiàn)在是25頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察由于大多數(shù)細(xì)胞的成分不影響光線的穿透，無(wú)法形成反差，所以在一般光學(xué)顯微鏡下，幾乎看不清未經(jīng)處理的細(xì)胞。為了看清細(xì)胞內(nèi)含物，就必須對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行一些特殊的處理，為此建立和發(fā)展了樣品的各種制備技術(shù)。

樣品的固定(fixation)目的:

生物組織在染色前先進(jìn)行固定的目的是殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時(shí)不會(huì)受到破壞現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四做法:

樣品固定的最簡(jiǎn)單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過(guò)程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價(jià)鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四包埋和切片樣品制備的第二步是將固定的組織制備成切片。樣品首先要被包埋在介質(zhì)中，通常用液態(tài)的石蠟或樹(shù)脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，然后將之硬化成固體的包埋塊；用專門(mén)的切片機(jī)切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為

l-10μm。現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四染色(staining)大多數(shù)細(xì)胞總重量的70%是水，對(duì)可見(jiàn)光幾乎是透明的，只有很少的內(nèi)含物不透光。染色的目的就是給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。19世紀(jì)初，發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)染料可染生物組織，并對(duì)細(xì)胞特殊部位的著色具有選擇性。如蘇木精對(duì)負(fù)電荷分子有親和性，能顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布；酸性染料如伊紅可使細(xì)胞質(zhì)染色；蘇丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對(duì)許多染料的特異性染色機(jī)理尚不清楚。

現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四2、電子顯微鏡技術(shù)

自從第一臺(tái)電子顯微鏡在德國(guó)誕生以來(lái)，取得飛躍發(fā)展并在生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。利用電鏡可以觀察到各種病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器的微細(xì)結(jié)構(gòu)，還能觀察到許多生物大分子。目前的電鏡已由單純的形態(tài)描述進(jìn)入了成分分析、定性和定量分析。此外，將電鏡與計(jì)算機(jī)連用，對(duì)圖象進(jìn)行信息處理也取得了很大進(jìn)展。

總之，電鏡已成為研究生物學(xué)的有力工具，必將發(fā)揮越來(lái)越大的作用?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四1932年德國(guó)學(xué)者M(jìn)axKnolls和ErnstRuska發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡，開(kāi)拓了超微世界，發(fā)現(xiàn)了許多光鏡下看不到的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞核、高爾基體、中心粒等細(xì)胞器的細(xì)微結(jié)構(gòu)。將在光學(xué)顯微鏡中觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopestructure)，或超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)。在種類上，電鏡可分為兩大類:透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差光鏡與電鏡的主要區(qū)別：（1）光源不同：光鏡為可見(jiàn)光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同：光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空（4）顯示記錄系統(tǒng)現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四透射電子顯微鏡(TEM)透射電子顯微鏡主要是讓電子束穿透樣片而成像。電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)由三大部分組成∶電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)、真空系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng))。電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機(jī)等組成。由于電子顯微鏡必需在高度真空條件下進(jìn)行工作，陰極與陽(yáng)極之間會(huì)放電，燈絲也會(huì)因受到氧化或被陽(yáng)離子轟擊而縮短壽命，所以設(shè)計(jì)了真空系統(tǒng)。電子學(xué)系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四電鏡(透射電鏡)與光鏡光路圖比較現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四電子顯微鏡的基本構(gòu)造現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四

掃描式電子顯微鏡

1940年，英國(guó)劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡。直到1965年，才有英國(guó)劍橋科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)出實(shí)用性強(qiáng)的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，因此，幾十年來(lái)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、地質(zhì)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及勘察、冶金，機(jī)械與輕工業(yè)等領(lǐng)域，成為十分有用的研究工具?，F(xiàn)在是40頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題?，F(xiàn)在是41頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四超薄切片技術(shù)取材—前固定(4%戊二醛)-PBS洗殘余的戊二醛后固定(4°C,鋨酸)--脫水(乙醇或丙酮包埋(環(huán)氧樹(shù)脂)修片切片(600埃，銀色)染色(醋酸鈾與鉛鹽)觀察

現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四●負(fù)染色(negativestainning)一些生物大分子組成的結(jié)構(gòu)，如病毒、線粒體基粒、核糖體和蛋白質(zhì)組成的纖維等可以通過(guò)負(fù)染色電鏡技術(shù)觀察其精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以從不同角度觀察三維結(jié)構(gòu)。

負(fù)染原理：又稱陰性反差染色，借助染色劑的襯托，增加背景對(duì)電子的散射，使樣品相對(duì)地透過(guò)較多的電子，最后在熒光屏上形成暗背景下的“亮像”?，F(xiàn)在是45頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四●冰凍斷裂復(fù)型和冰凍蝕刻是專門(mén)觀察樣品外表面的投影復(fù)型術(shù)現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四一、顯微鏡的種類及原理5.透射電子顯微鏡；6.掃描電子顯微鏡能否用掃描電鏡來(lái)觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而用透射電鏡來(lái)觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)？冰凍蝕刻技術(shù)現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四電鏡三維重構(gòu)技術(shù)現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四3、掃描遂道顯微鏡掃描隧道顯微鏡由IBM公司瑞士蘇黎世研究所的兩位學(xué)者BinningG.和RohrerH.等在1981年發(fā)明的具有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理而制成的。這種顯微鏡對(duì)生物、物理、化學(xué)等學(xué)科均有推動(dòng)作用，可用于研究表面的原子結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)，故于1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)?，F(xiàn)在是49頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為，縱分辨率可達(dá)0.01nm）；（2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。（4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四掃描隧道顯微鏡DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立是根據(jù)X射線衍射結(jié)果推導(dǎo)出來(lái)的，至今還沒(méi)有直接觀察DNA結(jié)構(gòu)的方法，所以對(duì)其中的微細(xì)結(jié)構(gòu)還不夠了解。用STM觀察了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，見(jiàn)到

DNA分子上的大溝和小溝，并且了解DNA的結(jié)構(gòu)隨染色體長(zhǎng)度而異。現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法離心分離技術(shù)細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性放射自顯影技術(shù)定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四一、離心分離技術(shù)離心分離細(xì)胞組分是最常用的分離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物。差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分。密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四●差速離心(differentialcentrifugation)主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的?，F(xiàn)在是55頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四差速離心現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四密度梯度離心現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量?，F(xiàn)在是58頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色?，F(xiàn)在是59頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四多糖的顯示方法PAS（過(guò)碘酸希夫氏）反應(yīng)利用過(guò)碘酸的強(qiáng)氧化作用破壞糖分子的C-C鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物?，F(xiàn)在是61頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四脂類物質(zhì)的顯示方法對(duì)脂類物質(zhì)的染色應(yīng)用的是物理的擴(kuò)散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時(shí)，它會(huì)脫離酒精而溶于脂類結(jié)構(gòu)中從而顯色?，F(xiàn)在是62頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四細(xì)胞中各種酶的顯示方法由于酶易受外界條件影響而變性失活。對(duì)酶的顯示一般采取間接的方法進(jìn)行，對(duì)可以與酶發(fā)生特異性結(jié)合的底物進(jìn)行染色從而達(dá)到顯示酶的目的。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中需在盡量保持酶的活性?，F(xiàn)在是63頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)：免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等?，F(xiàn)在是64頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四

細(xì)胞內(nèi)對(duì)于蛋白質(zhì)分子的定位技術(shù)包括免疫熒光、免疫印跡以及免疫電鏡等，這些技術(shù)都是基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性反應(yīng)的原理而設(shè)計(jì)的。將抗體分子上加上不同的可供識(shí)別的標(biāo)記，從而顯示出某種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位?？乖乖贵w特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記免疫酶標(biāo)記現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四免疫熒光技術(shù)現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四免疫電鏡技術(shù)現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四放射自顯影現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度測(cè)定術(shù)

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。

包括：紫外光顯微分光光度測(cè)定法；可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體?，F(xiàn)在是72頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四流式細(xì)胞儀現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。近年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)一系列主要理淪研究的進(jìn)展，如細(xì)胞全能性的揭示，細(xì)胞周期及其調(diào)控。癌變機(jī)制與細(xì)胞衰老，基因表達(dá)與調(diào)控，細(xì)胞融合以及一些細(xì)胞工程技術(shù)的建立都是與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分不開(kāi)的?，F(xiàn)在是74頁(yè)\一共有90頁(yè)\編輯于星期四

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞；繼代培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制細(xì)胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失2、植物細(xì)胞類型：原生質(zhì)體培養(yǎng)