蛋白誘導-LJ課件

實驗四基因的誘導表達與融合蛋白的純化實驗目的掌握基因誘導表達的原理與方法掌握蛋白質(zhì)純化的基本原理鞏固蛋白質(zhì)電泳的基本方法基因工程的下游技術(shù)基因的誘導表達和重組蛋白的純化二、表達瓶頸1、蛋白翻譯后折疊、修飾；2、蛋白翻譯后易降解、形成包涵體；3、蛋白分離純化、復性；4、基因表達調(diào)控。三、表達方式融合蛋白

1、基因融合：將兩個或多個開放閱讀框架按一定順序連接在一起，表達產(chǎn)物是一個雜和蛋白，靶蛋白連接在運載蛋白（識別標簽）的氨基端或羧基端。2、應(yīng)用潛力：

簡化靶蛋白的標記與分離；靶蛋白與信號肽連接，將靶蛋白分泌到特定細胞區(qū)；保護靶蛋白免受宿主蛋白酶降解；改善靶蛋白溶解性，防止形成包含體。識別標簽

β-半乳糖苷酶（lac-Z）谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）多聚組氨酸（poly-his）人工7肽FLAG人工標簽選擇表達載體常用的關(guān)鍵元件：啟動子和調(diào)節(jié)序列（表達強弱、細胞或組織特異性、表達調(diào)節(jié)等，如本實驗的乳糖操縱子。）融合基因（純化、標簽，或增強蛋白可溶性等。如GST融合蛋白用GST柱親和層析;多聚His標簽－6×His，便于鎳柱親和層析純化。）分泌信號篩選標記其它純化條件寬松由于螯合作用不受變性劑等因素的影響，故可在SDS或尿素等存在的條件下進行純化，這對一些溶解度不佳的重組蛋白的純化尤其有利。五、實驗流程：

細菌

親和層析IPTG誘導細菌總蛋白重組蛋白融合蛋白乳糖操縱子的特性SDS初步分析六、實驗原理

重組蛋白的表達方式與純化方式是由表達載體決定的。在原核表達系統(tǒng)，表達載體均攜帶一個條件表達的啟動子，由這一啟動子控制外源基因的表達。在未經(jīng)誘導的情況下，外源基因不表達，這就防止了外源基因產(chǎn)物對細菌正常生長的干擾。在細菌生長達到一定數(shù)量時再加入誘導劑誘導基因表達，可最大限度提高重組蛋白的產(chǎn)量。重組蛋白的表達與誘導劑加入的時間和濃度相關(guān)。表達產(chǎn)物:GST-目的蛋白Thestructureoflacoperon調(diào)節(jié)序列結(jié)構(gòu)基因I阻遏因子Repressorandnegativeregulation異丙基硫代半乳糖苷異半乳糖本實驗采用的pGEX4T-1表達載體，外源基因與GST形成GST-融合蛋白。由于GST能特異性結(jié)合谷胱甘肽，因此在純化時可利用偶聯(lián)谷胱甘肽的瓊脂糖凝膠進行親和層析，純化過程簡便且產(chǎn)物純度高。八、影響外源蛋白表達的主要因素細胞生長速率細胞生長溫度（20-37℃

）誘導劑濃度和誘導時間①首先進行小規(guī)模預實驗確定最佳條件②大規(guī)模培養(yǎng)進行提取、純化目的蛋白序號加入的100mMIPTG的體積（ul）IPTG終濃度（mM）誘導時間（小時）1（空質(zhì)粒）--42（112）--43（空質(zhì)粒）250.544（112）50.145（112）250.546（112）501.047（112）1002.048（112）2505.044.每管菌液3000rpm離心5分鐘，收集沉淀，棄上清。5.每管各加入200μl的上樣緩沖液，振蕩煮沸變性5分鐘備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。

PAGE原理

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；后者電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。

1.濃縮效應(yīng)(1)凝膠孔徑的不連續(xù)性(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

(3)電位梯度的不連續(xù)性2.分子篩效應(yīng)3.電荷效應(yīng)3．配制5%濃縮膠5ml：

30%Acr/Bis0.625ml1mol/LTrispH6.80.63mlH2O3.6ml10%SDS0.05ml10%過硫酸銨0.05mlTEMED0.005ml4．電泳(1)上樣20ul

(2)電泳濃縮膠段：80V/cm

分離膠段：120V/cm5．考馬斯亮藍染色：將電泳膠浸泡于考馬斯亮藍染色液中，室溫放置