基因操作主要技術(shù)原理

基因操作主要技術(shù)原理第一頁(yè)，共177頁(yè)。

基因操作技術(shù)主要包括（1）DNA分子的切割、連接、轉(zhuǎn)化（2）核酸分子雜交，凝膠電泳以及序列分析，基因的人工合成，PCR擴(kuò)增等第二頁(yè)，共177頁(yè)。第一節(jié)核酸的凝膠電泳第二節(jié)核酸分子雜交第三節(jié)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化第四節(jié)DNA序列分析第五節(jié)基因擴(kuò)增第六節(jié)基因的定點(diǎn)誘變第七節(jié)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的研究方法第三頁(yè)，共177頁(yè)。第一節(jié)核酸的凝膠電泳一、核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)1、簡(jiǎn)介

將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。第四頁(yè)，共177頁(yè)。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。第五頁(yè)，共177頁(yè)。2、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠：

瓊脂糖是從海藻中提取處理出來的一種線性聚合物。第六頁(yè)，共177頁(yè)。（1）瓊脂糖——海藻中提取的線性高聚物，電泳中EB染色，紫外燈下1ngDNA可以被檢測(cè)到分離作用依賴于DNA的分子量及構(gòu)型凝膠的種類及濃度對(duì)被分離的DNA的分子大小有影響第七頁(yè)，共177頁(yè)。第八頁(yè)，共177頁(yè)。第九頁(yè)，共177頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中

DNALadder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳第十頁(yè)，共177頁(yè)。（2）分辨能力

同凝膠的濃度相關(guān)，能分辨50-200kb的DNA片段，濃度越低，孔隙越大，分離的DNA越大第十一頁(yè)，共177頁(yè)。（3）影響DNA遷移率的因素①DNA分子量大小線狀DNA分子的遷移速率與其堿基數(shù)目以10為底的對(duì)數(shù)值成反比。分子量越大，摩擦力越大，越難于在凝膠空隙中蠕行，遷移得越慢。第十二頁(yè)，共177頁(yè)。第十三頁(yè)，共177頁(yè)。②瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀DNA片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同。第十四頁(yè)，共177頁(yè)。③

DNA的構(gòu)象分子量相同的超螺旋環(huán)狀，帶切口的環(huán)狀及線性DNA通過凝膠時(shí)速度不一。第十五頁(yè)，共177頁(yè)。第十六頁(yè)，共177頁(yè)。熔點(diǎn)在65oC的瓊脂糖凝膠，熔解后可在37oC保持液體形態(tài)，可直接用來回收DNA分子。（4）低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMP）LMP中的DNA分子加入苯酚抽提65oC加熱熔解LMP形成沉淀，DNA在上清離心分離第十七頁(yè)，共177頁(yè)。3、聚丙烯酰胺凝膠電泳①用于分離和純化雙鏈DNA的非變性電泳②用于分離和純化單鏈DNA的變性電泳，凝膠中加入抑制堿基配對(duì)的試劑（尿素、甲醛）第十八頁(yè)，共177頁(yè)。（1）原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N，N-四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡(jiǎn)稱AP)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱PAGE)。第十九頁(yè)，共177頁(yè)。第二十頁(yè)，共177頁(yè)。（2）聚丙烯酰胺凝膠分離范圍如下：第二十一頁(yè)，共177頁(yè)。（3）制備：凝膠鋪于兩塊玻璃板之間，兩塊玻璃板由間隔片所隔開，并封一絕緣膠布。第二十二頁(yè)，共177頁(yè)。（4）檢測(cè)方法

EB染色放射自顯影硝酸銀染色第二十三頁(yè)，共177頁(yè)。

聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析第二十四頁(yè)，共177頁(yè)。第二十五頁(yè)，共177頁(yè)。4、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）用于分離超大分子量的DNA，可分辨達(dá)到107bp的DNA分子原理：電場(chǎng)方向，電流大小和作用時(shí)間都在交替變換，使DNA分子能夠隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化第二十六頁(yè)，共177頁(yè)。45o夾角第二十七頁(yè)，共177頁(yè)。PFGEcanresolvelargeDNAfragments第二十八頁(yè)，共177頁(yè)。5、EB染色在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidiumbromide染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，能看到約1-10ngDNA所形成的條帶。第二十九頁(yè)，共177頁(yè)。溴化乙錠（EtBr）

一種具扁平分子的核酸染料，可插入到DNA或RNA分子的堿基之間。在300nm紫外燈照射下發(fā)射出熒光。第三十頁(yè)，共177頁(yè)。6、其他染色方法SYBRGreenI核酸染料高靈敏的DNA熒光染料，適用于各種電泳分析，操作簡(jiǎn)單：無需脫色或沖洗。至少可檢出20pgDNA，高于EB染色法25-100倍。SYBRGreenI與dsDNA結(jié)合熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝膠樣品熒光信號(hào)強(qiáng)，背景信號(hào)低。可適用于多種電泳分析。第三十一頁(yè)，共177頁(yè)。SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。第三十二頁(yè)，共177頁(yè)。銀染色銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.

也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收.第三十三頁(yè)，共177頁(yè)。DNA條帶大小及量的估算5000（bp）300020001000750500250100第三十四頁(yè)，共177頁(yè)。基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％焦碳酸二乙酯）來配制所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解；因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。6、RNA電泳第三十五頁(yè)，共177頁(yè)。第二節(jié)核酸分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。第三十六頁(yè)，共177頁(yè)。一、DNA/DNA印跡雜交——SouthernBlot1、原理將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。第三十七頁(yè)，共177頁(yè)。由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)

如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。第三十八頁(yè)，共177頁(yè)。2、SouthernBlot操作步驟DNA瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或顯色80℃烘干1～2hr第三十九頁(yè)，共177頁(yè)。紫外線交聯(lián)法：利用DNA分子上一小部分的胸腺嘧啶殘基同尼龍膜上的帶正電荷的氨基之間形成交聯(lián)鍵。第四十頁(yè)，共177頁(yè)。

轉(zhuǎn)移方法第四十一頁(yè)，共177頁(yè)。電泳凝膠預(yù)處理：為了使大小不等的DNA都得到轉(zhuǎn)移，要對(duì)凝膠作預(yù)處理，用0.25MHCl在溶液中作短暫的脫嘌呤處理后進(jìn)行堿變性，使DNA分子發(fā)生斷裂利于轉(zhuǎn)移，并且堿性條件下的單鏈狀態(tài)易于雜交第四十二頁(yè)，共177頁(yè)。放射自顯影照片第四十三頁(yè)，共177頁(yè)。SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽(yáng)性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。第四十四頁(yè)，共177頁(yè)。二、RNA/RNA印跡雜交－Northernblotting1、原理

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northernblotting。第四十五頁(yè)，共177頁(yè)。2、操作過程mRNA提取甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光第四十六頁(yè)，共177頁(yè)。三、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交

斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的快速檢測(cè)特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置（多孔過濾進(jìn)樣器），使眾多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。第四十七頁(yè)，共177頁(yè)。DotblotSlotblot

儀器SampleDNA點(diǎn)陣第四十八頁(yè)，共177頁(yè)。DNAchip

芯片ResultofanalysisDNA(cDNA,synthesizedoligonucleotide)Fluorescencelabeledsamples（cDNA）第四十九頁(yè)，共177頁(yè)。檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)5、菌落雜交第五十頁(yè)，共177頁(yè)。核酸雜交常用幾種膜的性能比較第五十一頁(yè)，共177頁(yè)。四、Probe(探針)

NotesProbeisaspecificDNAorRNAfragmentwhichcanbindwiththesampleDNAorRNAfordetection.eg：ATCCGATCGSourceofprobesynthesized,cloninggenomicDNAorcDNA,aswellasRNA.Probemustbelabeled(標(biāo)記)beforehybridization.radioactive——αorγ32Pnonradioactive——biotin,digoxigenin(地高辛),fluorescentdyeInasinglestrandedformforhybridization第五十二頁(yè)，共177頁(yè)。核酸分子雜交法的技術(shù)路線比較菌落原位雜交菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到膜上抽提DNA/RNA提取DNA提取RNA裂解細(xì)菌或噬菌斑變性核酸樣品瓊脂糖凝膠電泳變性DNA將核酸點(diǎn)加到膜上將凝膠上核酸條帶轉(zhuǎn)移到膜上，同時(shí)變性將核酸固定在膜上→預(yù)雜交（消除非特異吸附位點(diǎn)）→加入核素標(biāo)記探針進(jìn)行雜交→漂洗膜（洗去非特異結(jié)合探針）→放射自顯影或顯色反應(yīng)示蹤斑點(diǎn)雜交Southern印跡Northern印跡第五十三頁(yè)，共177頁(yè)。一、轉(zhuǎn)化——以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞1928年,Avery首次開展了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)感受態(tài)細(xì)菌——是指細(xì)菌處于容易接受外源DNA的狀態(tài)。有的細(xì)菌在生長(zhǎng)周期任何時(shí)候自動(dòng)產(chǎn)生如枯草、嗜血桿菌。有的在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)生，如E.coli。產(chǎn)生機(jī)制不明。第三節(jié)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化第五十四頁(yè)，共177頁(yè)。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)菌）從周圍介質(zhì)中吸收來自另一種基因型細(xì)胞的DNA,進(jìn)而使原來細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。常見轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法。第五十五頁(yè)，共177頁(yè)。（一）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法除去細(xì)胞壁后加外源DNA，經(jīng)吸收恢復(fù)再生培養(yǎng)，如枯草桿菌。例如：酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化利用蝸牛酶、松解酶等消化酵母細(xì)胞形成原生質(zhì)體，在聚乙二醇和氯化鈣的作用下，使DNA被俘獲。第五十六頁(yè)，共177頁(yè)。（二）化學(xué)轉(zhuǎn)化法1970年Mandel和Higa首先用CaCl2經(jīng)短暫的熱休克后，可使外源DNA轉(zhuǎn)入E.coli。通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)105-107轉(zhuǎn)化子/μgDNA。第五十七頁(yè)，共177頁(yè)。大腸桿菌在0℃的CaCl2溶液中形成原生質(zhì)球使之呈感受態(tài)（CompetentCells）加入DNA，42℃做短暫休克（90s），黏附在細(xì)胞表面的DNA進(jìn)入篩選轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記1、原理

用冷CaCl2低滲處理E.coli使菌體成球形，外源DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物而被吸附，經(jīng)短暫42℃熱休克，易于進(jìn)入胞內(nèi)而不被降解。第五十八頁(yè)，共177頁(yè)。（三）電穿孔法原理：利用高壓脈沖電場(chǎng),在宿主細(xì)胞表面形成暫時(shí)性的微孔,質(zhì)粒DNA可乘隙而入,在脈沖過后,微孔復(fù)原。比CaCl2法操作更簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高（一般可達(dá)109～1010個(gè)轉(zhuǎn)化子／μgDNA）,不僅無需制備感受態(tài)細(xì)胞,而且適用于任何菌株。第五十九頁(yè)，共177頁(yè)。第六十頁(yè)，共177頁(yè)。二、細(xì)菌轉(zhuǎn)化頻率影響因素：1、DNADNA濃度、純度、構(gòu)型2、轉(zhuǎn)化的條件溫度、pH、離子強(qiáng)度等3、限制修飾系統(tǒng)一般選用寄主控制的限制和修飾系統(tǒng)上有缺陷的突變體，hsdR-和hsdM-突變體。第六十一頁(yè)，共177頁(yè)。三、真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染1、轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；人造膜顯微注射2、篩選標(biāo)志

tk-NeorG418瞬時(shí)轉(zhuǎn)染目的基因不整合進(jìn)宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因整合進(jìn)宿主基因組第六十二頁(yè)，共177頁(yè)。磷酸鈣沉淀法:Ca2+促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收外源DNA細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，將待轉(zhuǎn)移的DNA加入氯化鈣和磷酸鹽，生成DNA-磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中，由于細(xì)胞的吞噬作用，DNA-磷酸鈣沉淀物進(jìn)入細(xì)胞，DNA釋出后先進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、再進(jìn)入細(xì)胞核。微量注射：一臺(tái)儀器每小時(shí)注射500-1000個(gè)細(xì)胞，約50%的細(xì)胞能穩(wěn)定地整合并表達(dá)，任何DNA都可注射到任何細(xì)胞中，效率高，不需篩選壓力，但需要昂貴的儀器，技術(shù)復(fù)雜，難以掌握。第六十三頁(yè)，共177頁(yè)。脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)

·形成囊狀結(jié)構(gòu)可將DNA包在其中

·帶有外源DNA的脂質(zhì)體通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞，達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的電轉(zhuǎn)移法

受體細(xì)胞與外源DNA按一定比例混合后，放入電脈沖槽中，經(jīng)用脈沖電壓刺激，外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞（或受精卵）第六十四頁(yè)，共177頁(yè)。neor新霉素：細(xì)菌抗生素，干擾原核生物蛋白質(zhì)合成，對(duì)真核生物沒有抑制作用G418：新霉素的類似物G418對(duì)真核細(xì)胞及原核細(xì)胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使G418失活（neo基因編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶），細(xì)胞可以生長(zhǎng)。neo：新霉素抗性基因，磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418失活neo與目的基因連鎖，轉(zhuǎn)染3、真核細(xì)胞的篩選標(biāo)記第六十五頁(yè)，共177頁(yè)。新霉素類藥物G418篩選AmNeoPoriG418（-）蛋白質(zhì)合成第六十六頁(yè)，共177頁(yè)。1、Sanger的雙脫氧鏈終止法Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列。其基本原理如下：

①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。一、DNA鏈末端合成終止法第四節(jié)DNA序列分析第六十七頁(yè)，共177頁(yè)。第六十八頁(yè)，共177頁(yè)。2、雙脫氧－M13體系DNA序列分析法

M13含單鏈DNA，在細(xì)菌內(nèi)形成雙鏈環(huán)狀DNA（RF）。成熟噬菌體含單鏈DNA分泌到培養(yǎng)液中。雙鏈DNA（RF）：克隆載體，按提取質(zhì)粒方法從細(xì)菌中制備單鏈DNA：測(cè)序模板，從培養(yǎng)基的上清中提取目前常用的M13mp18第六十九頁(yè)，共177頁(yè)。第七十頁(yè)，共177頁(yè)。注意：1、膠放射自顯影后讀序列，變性序列膠濃度20％左右PAGE2、膠上讀出序列為測(cè)序鏈的3’——5’方向3、引物標(biāo)記第七十一頁(yè)，共177頁(yè)。3’5’ddTddAddGddCAAAAACAACGAACGGAACGGTAACGGTAAACGGTACAACGGTACAAACGGTACAC第七十二頁(yè)，共177頁(yè)。二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué))

該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。第七十三頁(yè)，共177頁(yè)。專門用來對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。

硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性pH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。加入六氫吡啶斷裂G；在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1mol/L的NaCl，那么，只有C被特異性切割。第七十四頁(yè)，共177頁(yè)。硫酸二甲酯——A＋G硫酸二甲酯————G肼——C＋T肼————C中性六氫吡啶堿性1MNaCl第七十五頁(yè)，共177頁(yè)。第七十六頁(yè)，共177頁(yè)。放射性標(biāo)記：5’端：T4多核苷酸激酶3’端：T4DNA聚合酶決定從膠上讀出的順序第七十七頁(yè)，共177頁(yè)。

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼第七十八頁(yè)，共177頁(yè)。Maxam-Gilbert化學(xué)修飾－CS載體系統(tǒng)DNA分析pSP64CS載體：在其同DNA克隆片段相鄰的位置有一個(gè)核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，Tth111Ⅰ，位點(diǎn)GACN↓NNGTCCGACTGAGTCCTGACTCAGGACTGAGTCCTGACTCAGABTth111Ⅰ酶切Klenow大片段選擇性標(biāo)記3’末端[32p-dNTP]GACTGAGTCCTGACTCAGGACTGAGTCCTGACTCAGGAGTC*CTCAGGACTG*CTGAC第七十九頁(yè)，共177頁(yè)。優(yōu)越性：1、切割DNA后產(chǎn)生突出的5’端，所以補(bǔ)平后每個(gè)末端只有一個(gè)放射性標(biāo)記2、Tth111Ⅰ非常稀少，不會(huì)對(duì)測(cè)序DNA造成影響3、在載體中有兩個(gè)Tth111Ⅰ位點(diǎn)，即可以對(duì)其位點(diǎn)間的DNA測(cè)序第八十頁(yè)，共177頁(yè)。不需要進(jìn)行體外酶切，只要使用具有末端標(biāo)記的DNA，單、雙鏈都可以測(cè)序；不同的末端標(biāo)記方法，可以讀出彼此互補(bǔ)的兩條鏈限制于序列膠的分辨能力Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法優(yōu)點(diǎn)第八十一頁(yè)，共177頁(yè)。三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光（四甲基若丹明，Tetramethylrhodamine）替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。第八十二頁(yè)，共177頁(yè)。DNA的測(cè)序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動(dòng)方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件第八十三頁(yè)，共177頁(yè)。多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測(cè)序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記，平板電泳到毛細(xì)管電泳第八十四頁(yè)，共177頁(yè)。一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標(biāo)記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

測(cè)序反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，除去過量的ddNTP后上樣。第八十五頁(yè)，共177頁(yè)。一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。4個(gè)反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP

反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣第八十六頁(yè)，共177頁(yè)。第八十七頁(yè)，共177頁(yè)。DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例第八十八頁(yè)，共177頁(yè)。四、DNA雜交測(cè)序法(SBH-Sequencingbyhybridization)

如果一段較短的DNA探針能與較長(zhǎng)的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本原理。用一組已知系列的寡核苷酸短序列做為探針，同某一較長(zhǎng)的靶DNA分子雜交，從而測(cè)定其序列。避免的傳統(tǒng)測(cè)序的酶切或者化學(xué)反應(yīng)第八十九頁(yè)，共177頁(yè)。一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在48=65536種8-mer的探針群體中，僅有5種探針會(huì)與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。

沒有完全互補(bǔ)的會(huì)形成不穩(wěn)定的雙鏈分子，雜交效率會(huì)明顯下降第九十頁(yè)，共177頁(yè)。第九十一頁(yè)，共177頁(yè)。寡核苷酸矩陣芯片（SHOM）通過連接在DNA末端的活化接頭與玻璃或者凝膠共價(jià)結(jié)合，把寡核苷酸固定成二維陣列形式，做成測(cè)序芯片，可以用來進(jìn)行有效的DNA雜交。雜交的檢測(cè)（圖2-18）探針以同位素或者熒光標(biāo)記，可用磷光成像儀和特定軟件分析。第九十二頁(yè)，共177頁(yè)。當(dāng)靶DNA與標(biāo)記探針形成G-T或G-A末端堿基錯(cuò)配的雙鏈體時(shí)，檢測(cè)有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。但是，探針短，雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降，信/噪比下降，影響結(jié)果的可靠性。6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測(cè)定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。

新一代高通量測(cè)序第九十三頁(yè)，共177頁(yè)。一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建（polymerasechainreaction）KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年

Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第五節(jié)基因擴(kuò)增第九十四頁(yè)，共177頁(yè)。KaryB.Mullis第九十五頁(yè)，共177頁(yè)。三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

第九十六頁(yè)，共177頁(yè)。二、技術(shù)原理1、原理DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增。擴(kuò)增的公式為:

Nf＝No（1＋Y）n

式中

N0——起始拷貝數(shù)

Y——擴(kuò)增效率;n——循環(huán)次數(shù)。第九十七頁(yè)，共177頁(yè)。RateofPCR2nNo＝1Y＝1Nf＝2nInitial

DNA

8421NumberofDNAmolecules第九十八頁(yè)，共177頁(yè)。靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第九十九頁(yè)，共177頁(yè)。溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。第一百頁(yè)，共177頁(yè)。TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength第一百零一頁(yè)，共177頁(yè)。ReactionConditionforaTypicalPCRAssay第一百零二頁(yè)，共177頁(yè)。2、SomeDNAPolymerasesUsedinPCRKlenowfragmentofE.coli

則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

Taqpolymerase，則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來的。

pfu，從海洋附近火山口生活的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，比Taq具有更高的擴(kuò)增準(zhǔn)確性，具有3’-5’外切酶活力，可以修復(fù)錯(cuò)配。第一百零三頁(yè)，共177頁(yè)。①KlenowfragmentofE.Coli最適反應(yīng)溫度37℃，容易使DNA引物與模板之間形成非專一的堿基錯(cuò)配，或容易受某些DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，在擴(kuò)增結(jié)果中產(chǎn)生非特異的DNA條帶，降低特異性。在變性溫度下會(huì)失活，需要不斷添加酶第一百零四頁(yè)，共177頁(yè)。72℃94℃55℃PCR循環(huán)第一百零五頁(yè)，共177頁(yè)。②TaqDNA聚合酶水生棲熱菌(Thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶

5’3’DNA聚合酶活性無3’5’外切酶活性，35輪0.25%錯(cuò)配，與原始模板有差別；最適聚合酶溫度72℃，連續(xù)保溫30min具有相當(dāng)活力，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5－6min

變性溫度：≤95℃使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性第一百零六頁(yè)，共177頁(yè)。CharacteristicsofTaqPolymerase1-2kb/min第一百零七頁(yè)，共177頁(yè)。②pfuDNA聚合酶耐熱5’3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精確度：pfu>Taq

但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu會(huì)起到較好效果第一百零八頁(yè)，共177頁(yè)。3、引物人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，Tm值要相近，每條10-50pmol/100l

◆設(shè)計(jì)原則：（1）引物長(zhǎng)度

15～30個(gè)堿基引物太短，可能同非靶序列雜交，產(chǎn)生非特異條帶例如：長(zhǎng)8bp引物，平均每隔48＝65536個(gè)bp會(huì)出現(xiàn)一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在3×109bp的基因組中會(huì)有可能43000個(gè)結(jié)合點(diǎn)；長(zhǎng)17bp的引物，平均每隔417＝1.7×1011個(gè)bp會(huì)出現(xiàn)一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在3×109bp的基因組中會(huì)有可能1個(gè)結(jié)合點(diǎn)第一百零九頁(yè)，共177頁(yè)。5'GCTCCATGACCCAGGCGATCTTTTGAGTCCAA3'3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'下游P上游P5'GCTCCATGACCCAG3'5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'正鏈5’3’負(fù)鏈3’5’（2）靠近5’上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同，3’下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同。第一百一十頁(yè)，共177頁(yè)。（2）Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列形成loop環(huán)，內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Primer間互補(bǔ)序列導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer

一般不要超過3個(gè)互補(bǔ)bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC第一百一十一頁(yè)，共177頁(yè)。修飾如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5’CGCTCCATGACCCAG3’

注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸（4）Primer5’未端可修飾、突變第一百一十二頁(yè)，共177頁(yè)。（5）primer5’端增加堿基

①內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保護(hù)bp作用：對(duì)PCR產(chǎn)物cloning有很大好處便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適→影響內(nèi)切酶消化→影響下步克隆，若未切開，連接不上。

第一百一十三頁(yè)，共177頁(yè)。第一百一十四頁(yè)，共177頁(yè)。第一百一十五頁(yè)，共177頁(yè)。②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。第一百一十六頁(yè)，共177頁(yè)。（6）簡(jiǎn)并引物由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。需要注意變性溫度，以避免引物與模板的錯(cuò)配，可以采用“熱起始”法：把混合物加熱到72℃，然后加入TaqDNA聚合酶。第一百一十七頁(yè)，共177頁(yè)。熱啟動(dòng)PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm的溫度下哪怕做短暫的保溫也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對(duì)，采用熱啟動(dòng)PCR，在第一個(gè)循環(huán)中等溫度升高到超過反應(yīng)物的Tm后再加入酶，減少錯(cuò)配。第一百一十八頁(yè)，共177頁(yè)。（7）嵌套引物為了盡可能的減少非靶序列的擴(kuò)增利用第一次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物做為第二次擴(kuò)增的模板。第一百一十九頁(yè)，共177頁(yè)。4、模板

DNAmRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNADNA包括：質(zhì)粒、噬菌體、染色體DNA

哺乳動(dòng)物基因組：0.1～1μg，對(duì)于可再現(xiàn)PCR，建議DNA用量少于10μg

細(xì)菌基因組或者質(zhì)粒：pg（10-12）到ng級(jí)（10-9）直接以細(xì)胞為模板，例如直接從人1×105人細(xì)胞中（預(yù)先用蛋白酶打開）直接擴(kuò)增出黃磦呤-鳥磦呤核糖轉(zhuǎn)移酶基因（HPRT）一個(gè)片段。防止交叉污染第一百二十頁(yè)，共177頁(yè)。5、dNTP四種脫氧核苷酸，基本原料終濃度：50M注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效第一百二十一頁(yè)，共177頁(yè)。6、Mg2+（1）不同的酶需不同Mg2+Taq：TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+較少，Mg2+

對(duì)反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍（2）外界影響：

EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris-HCl，1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+有效濃度?！嗳绻麛U(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度。第一百二十二頁(yè)，共177頁(yè)。7、溫度和時(shí)間（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長(zhǎng)度很長(zhǎng)，則變性T↑（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑Tm↓退火T↓

若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：500nt——1min500nt——3min

一般：40－60sec第一百二十三頁(yè)，共177頁(yè)。三、指數(shù)期PCR在大多數(shù)情況下，一旦目的片段達(dá)到1012（Nf），每次循環(huán)的效率（Y）就大大降低，產(chǎn)物停止指數(shù)積累；效率的降低可能反應(yīng)了酶已經(jīng)成為反應(yīng)的限制因素，此期以外的擴(kuò)增通常導(dǎo)致非特異性條帶的擴(kuò)增、小的缺失突變體出現(xiàn)。第一百二十四頁(yè)，共177頁(yè)。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴(kuò)增過程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增.Nf＝No（1＋Y）n第一百二十五頁(yè)，共177頁(yè)。N0＝105107109101110131002030405060Nf＝No（1＋Y）n過渡擴(kuò)增靶序列數(shù)Nf循環(huán)數(shù)nPCR過程中靶序列的積累與循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系，在標(biāo)準(zhǔn)Taq反應(yīng)體系下，以105

（N0）基因?yàn)槟０澹謩e在20，25，至60個(gè)循環(huán)（n）取出2.5μL，在PAGE上分析，根據(jù)EB染色后帶的密度估計(jì)每階段產(chǎn)生的靶序列數(shù)Nf，在30個(gè)循環(huán)時(shí)加入Taq酶。第一百二十六頁(yè)，共177頁(yè)。第一百二十七頁(yè)，共177頁(yè)。是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。已知序列未知序列未知序列三、PCR技術(shù)的研究應(yīng)用1、反向PCR第一百二十八頁(yè)，共177頁(yè)。

用在靶DNA內(nèi)無切點(diǎn)的內(nèi)切酶從該區(qū)段的兩端切割，產(chǎn)生帶有靶DNA的片段（<2～3kb）用連接酶把切割片段連接成環(huán)形分子按靶DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)向外的引物，用其與靶DNA5’端互補(bǔ)作用進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到靶序列兩側(cè)的序列。引物1引物2第一百二十九頁(yè)，共177頁(yè)。2、不對(duì)稱PCR為了獲得更好的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果，有時(shí)采用不對(duì)稱PCR方法。在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，把一個(gè)引物減少到常規(guī)用量的1/50左右（稱為限制性引物）。其最佳比例一般是0.01∶0.5μM在前十幾個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增合成一定量的雙股DNA，限制性引物被逐漸耗盡。在后十幾個(gè)循環(huán)中，只有加入了常規(guī)量的那個(gè)引物與模板形成復(fù)合物并發(fā)生鏈延伸，只合成單股DNA，可以此單股DNA為模板用末端終止法測(cè)序。（圖2-38）第一百三十頁(yè)，共177頁(yè)。適用引物合成新鏈加熱、引物退火加熱、引物退火無適用引物反應(yīng)結(jié)束，體系中高濃度引物合成的DNA比限制引物多，并且是單鏈形式第一百三十一頁(yè)，共177頁(yè)。3、RT-PCR在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈第一百三十二頁(yè)，共177頁(yè)。①RT-PCR——應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNAmRNA的分離AAAAcDNA的合成p1Oligo(dT)引導(dǎo)AAAAAAAATTTTT基因特異性引物引導(dǎo)隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)N6第一百三十三頁(yè)，共177頁(yè)。AAAAcDNA的合成p1Oligo(dT)引導(dǎo)AAAAAAAATTTTT基因特異性引物引導(dǎo)隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)N6RNaseH處理mRNADNAAAAAp1RNA被降解成小片段加入上游引物引導(dǎo)cDNA第二鏈合成DNA雙鏈p1p2p1’第一百三十四頁(yè)，共177頁(yè)。②熒光定量PCR技術(shù)

在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。第一百三十五頁(yè)，共177頁(yè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。第一百三十六頁(yè)，共177頁(yè)。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。第一百三十七頁(yè)，共177頁(yè)。SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。第一百三十八頁(yè)，共177頁(yè)。4、RAPDRAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。

第一百三十九頁(yè)，共177頁(yè)。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，對(duì)于任一特異的引物，它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn)。這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置，且引物3‘端相距在一定的長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，就可擴(kuò)增出DNA片段。如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。第一百四十頁(yè)，共177頁(yè)。若位點(diǎn)2處堿基發(fā)生改變第一百四十一頁(yè)，共177頁(yè)。RAPD電泳結(jié)果圖第一百四十二頁(yè)，共177頁(yè)。

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。一、盒式誘變（cassettemutagenesis）包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。第六節(jié)基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis）第一百四十三頁(yè)，共177頁(yè)。1、盒式取代誘變利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相應(yīng)序列。寡核苷酸盒：由兩條合成的寡核苷酸組成，當(dāng)他們退火時(shí)，會(huì)按著設(shè)計(jì)形成克隆需要的粘性末端。第一百四十四頁(yè)，共177頁(yè)。寡核苷酸盒EcoRIHindIII第一百四十五頁(yè)，共177頁(yè)。2、利用摻假的寡核苷酸進(jìn)行的盒式誘變?cè)诓徽_的核苷酸能夠低頻率的摻入條件下，合成了兩條具有30bp可以和GRE（糖皮質(zhì)激素效益元件）互補(bǔ)的寡核苷酸序列。第一百四十六頁(yè)，共177頁(yè)。二、寡核苷酸引物誘變

（一）誘變?cè)?/p>

1、應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。第一百四十七頁(yè)，共177頁(yè)。2、引物引物與目的基因形成的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性決定于堿基的組成，核苷酸的錯(cuò)配和引物的長(zhǎng)度，引物長(zhǎng)8～18個(gè)核苷酸。3、聚合酶錯(cuò)配堿基要得到保護(hù)，避免受到大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ5’→3’外切酶刪除，使用Klenow可以消除5’→3’外切酶活力。3’端還有錯(cuò)配堿基以外的堿基可以抵制DNA聚合酶Ⅰ3’→5’外切酶活力第一百四十八頁(yè)，共177頁(yè)。利用M13載體的好處：可以簡(jiǎn)單快速的分離到單鏈的模板，并且可以用放射性同位素標(biāo)記的誘變寡核苷酸做探針，可以容易的篩選出突變體克隆（二）誘變過程第一百四十九頁(yè)，共177頁(yè)。1、正鏈DNA的合成2、突變引物的合成3、異源雙鏈DNA分子的制備

Klenow酶和T4DNA連接酶退火在低溫下進(jìn)行，因?yàn)樾纬傻碾p鏈短、有錯(cuò)配不穩(wěn)定。第一百五十頁(yè)，共177頁(yè)。4、閉環(huán)雙鏈DNA分子的富集單鏈和具有切口的雙鏈M13轉(zhuǎn)化E.coli有較高本底運(yùn)用SI核酸酶處理5、轉(zhuǎn)化產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)化子，一種野生型，一種突變型6、突變體的篩選雜交篩選，用放射性同位素標(biāo)記的誘變寡核苷酸做探針7、突變基因的鑒定第一百五十一頁(yè)，共177頁(yè)。（三）局限性突變效率受到多種因素制約①異源雙鏈分子中含有沒有配對(duì)的非突變單鏈模板及局部雙鏈DNA分子②經(jīng)過體內(nèi)DNA復(fù)制后，異源雙鏈DNA分子經(jīng)過半保留復(fù)制后，會(huì)產(chǎn)生出突變體和非突變體的混合群體。第一百五十二頁(yè)，共177頁(yè)。（四）提高突變效率的方法理論上來說，DNA是半保留復(fù)制的，應(yīng)用寡核苷酸定點(diǎn)誘變時(shí)，所形成的噬菌體中攜帶突變基因的應(yīng)為一半。但實(shí)際上，由于技術(shù)上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突變基因的噬菌體。因此，為了獲得更多含有突變噬菌體的噬菌斑，必須提高突變體的比率。目前已有多種改良的寡核苷酸定點(diǎn)誘變方法，此處將Kunkel于1985年建立的方法做以簡(jiǎn)單介紹。第一百五十三頁(yè)，共177頁(yè)。1、Kunkel定點(diǎn)誘變法是一種通過篩除含有尿嘧啶的DNA模板鏈進(jìn)行的寡核苷酸定點(diǎn)誘變法。原理：①將待突變的基因克隆入RF-M13DNA載體上，導(dǎo)入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（ung-）雙缺陷的大腸桿菌（dut-，ung-）菌株中。第一百五十四頁(yè)，共177頁(yè)。②dUTP酶缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升，并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈中。又由于ung缺陷使摻入DNA的dUTP殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈DNA大約有1%的T被U所取代，然后進(jìn)行DNA定點(diǎn)誘變。第一百五十五頁(yè)，共177頁(yè)。③雙鏈DNA導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基。結(jié)果原來的M13模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體中含有突變DNA的比例大大增加。第一百五十六頁(yè)，共177頁(yè)。2、硫代磷酸誘變法利用AvaⅠ，AvaⅡ，BanⅡ，HindⅡ、NciⅠ，PstⅠ，PvuⅠ等酶無法切割硫代磷酸DNA分子的方法建立。POOHOOHPOOOHPSOCH2OHOOH堿基硫代核苷酸第一百五十七頁(yè)，共177頁(yè)。

將寡核苷酸與M13退火，在具有硫代核苷酸的反應(yīng)條件下，由DNA聚合酶催化延伸，突變體鏈?zhǔn)橇虼姿峄腄NA；連接酶封閉切口；用NciI切割，只能切割親本鏈；核酸外切酶局部消化進(jìn)行聚合反應(yīng)第一百五十八頁(yè)，共177頁(yè)。三、PCR誘變1、重組PCR定點(diǎn)誘變①設(shè)置兩個(gè)反應(yīng)管，在每一個(gè)反應(yīng)管中加入兩種特定的引物，其中引物A和A’均含有錯(cuò)配核苷酸，但兩個(gè)引物其他序列與質(zhì)粒DNA的不同鏈完全互補(bǔ)，引物B和C均不含有錯(cuò)配核苷酸；②進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含有突變堿基的DNA分子；第一百五十九頁(yè)，共177頁(yè)。④將兩個(gè)反應(yīng)管中的DNA混合，再經(jīng)過變性和復(fù)性，一個(gè)反應(yīng)管中的一條鏈和另一個(gè)反應(yīng)管中的互補(bǔ)鏈雜交，形成兩種雜交分子1、2；⑤其中1具有5’端凹陷，不能做為DNA聚合酶的底物，2具有3’端凹陷，做為DNA聚合酶的底物，延伸為完整雙鏈；⑥用B和C做引物進(jìn)行PCR。12第一百六十頁(yè)，共177頁(yè)。2、大引物誘變

以第一輪的PCR產(chǎn)物做為第二輪的引物；

TaqDNA聚合酶的保真性不高，需要經(jīng)過測(cè)序確定正確性。第一百六十一頁(yè)，共177頁(yè)。第七節(jié)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的研究方法（一）凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay），又稱DNA遷移率變化試驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay，DMSA）1、原理DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合第一百六十二頁(yè)，共177頁(yè)。2、步驟（1）放射性同位素標(biāo)記的DNA與蛋白質(zhì)溫育；（2）加