桔梗中皂苷類組分物質(zhì)抑制血管生成作用實驗研究

桔梗中皂苷類組分物質(zhì)抑制血管生成作用實驗研究［摘要］目的：研究桔梗中皂苷類組分物質(zhì)（SCPG）對血管生成的影響。方法：采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型來研究SCPG抑制血管生成作用。結(jié)果：SCPG25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL劑量組對HUVEC增殖和CAM血管生成均有抑制作用。與模型組比較，對HUVEC增殖的抑制率分別為6.31%、15.45%、31.12%；對CAM的抑制率分別為7.99%、13.49%、26.08%。結(jié)論：SCPG具有良好的血管生成抑制作用，并呈劑量依賴性關(guān)系。關(guān)鍵詞：桔梗中皂苷類組分物質(zhì)（SCPG）；人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）；雞胚尿囊模（CAM）；血管生成

Anti-angiogenicActivityofSaponinComponentsfromPlatycodonGrandiflorum[Abstract]Objective:Tostudytheanti-angiogenicactivityofsaponincomponentsfromPlatycodongrandiflorum(SCPG).Methods:Humanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)andchickenchorioallantoicmembrane(CAM)modelwereusedtoevaluatetheanti-angiogenesiseffectofSCPG.Results:SCPGinhibitedtheproliferationofHUVECandtheangiogenesisofCAMat25、50and100μg/mL.Comparedwiththemodelcontrolgroup,theinhibitionrateoftheproliferationofHUVECwere6.31%、15.45%、31.12%,andtheinhibitionrateoftheangiogenesisofCAMwere7.99%、13.49%、26.08%,respectively.Conclusion:SCPGhasgoodanti-angiogenicactivitiesinadosedependentmanner.[Keywords]saponincomponentsfromPlatycodongrandiflorum(SCPG);Humanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC);chickenchorioallantoicmembrane(CAM);angiogenesis

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum

(Jacq.)A.DC.的根，為傳統(tǒng)常用鎮(zhèn)咳祛痰藥之一。最早收載于我國現(xiàn)存最早的藥物學專著《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主胸脅痛如刀刺，腹?jié)M腸鳴幽幽，驚恐悸氣。”它具有廣泛的生物活性，如解熱鎮(zhèn)痛抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)咳、降血糖血脂、抑制胃酸分泌及抗胃潰瘍和免疫調(diào)節(jié)等作用。據(jù)有關(guān)文獻報道，其水提取液或醇提取液有較強的抗癌活性[1]。李偉等[2]也報道桔梗皂苷中多種組分具有體外抗腫瘤活性[2]。但至今未見有學者對桔梗成分進行抑制血管生成作用的研究。為此，筆者將采用HUVEC和CAM模型分別從體外和體內(nèi)對桔梗中皂苷類組分進行研究。希望能為桔梗中苷類成分作為瘤新生血管生成抑制劑（tumorangiogenesisinhibitor，TAI[3]）開發(fā)提供理論依據(jù)，也為桔梗藥材開發(fā)抗腫瘤藥物提供更多思路。1材料1.1藥品與試劑桔梗中皂苷類組分物質(zhì)（SCPG，含量≥80%)，由揚州大學藥物研究所中藥及天然藥物研究室提供。用無菌蒸餾水配制為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL3個濃度劑量組。參一膠囊（吉林亞泰制藥生產(chǎn)，批號090103）用無菌蒸餾水按人參皂苷Rg3含量配制為50μg/mL。小牛血清（杭州四季青生物工程材料，批號080503）；高糖DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，批號748854）；胰酶（生工生物工程上海，批號2907B503）；四甲基偶氮唑鹽(MTT，上海藍季科技發(fā)展，批號1320219)；苯扎溴銨（新潔爾滅，南昌白云藥業(yè)，批號090603）；碘伏（常熟市星海制藥，批號071103）95%乙醇、甲醛（分析純，上海蘇懿化學試劑，批號070701、090820）。1.2動物與細胞株SPF級受精種蛋由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2021-0009，使用許可證號SYXK(蘇)2021-0045；HUVEC，購自南京凱基生物科技發(fā)展。1.3儀器SW-CJ-1D超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備），細胞培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備），LRH-250-S恒溫培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠），CKX41倒置顯微鏡（OLYMPUSCORPORATION），XS-212-202解剖顯微鏡（JNOEC），COOLPIⅹs560數(shù)碼相機(日本-Nikon)1000萬像素，可調(diào)移液器（Eppendorf公司）2方法2.1HUVEC培養(yǎng)將所購HUVEC加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度的無菌細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。2.2MTT法檢測SCPG對HUVEC細胞增殖的影響取對數(shù)生長期HUVEC細胞接種于96孔板，調(diào)整細胞密度為5×103個/孔。常規(guī)培養(yǎng)24h，換以用不含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液配制的SCPG溶液200μL，SCPG的質(zhì)量濃度分別為25、50、100μg/mL，同時設(shè)空白對照組。每個實驗組設(shè)6個平行孔，培養(yǎng)24h后，于每孔加入20μL的MTT，繼續(xù)孵育4h，棄上清，再加入150μL二甲基亞砜（dimethylsulphoxide,DMSO）。微量振蕩儀振蕩10min后，使甲臜結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測490nm波長處每孔的吸收度（A值）。并按以下公式計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=[(空白組A值-給藥組A值)/空白組A值]×100%2.3雞胚孵育與分組SPF級受精種蛋選取質(zhì)量在（50±2）g種蛋50枚，并隨機分為5個實驗組。分別為模型對照組，SCPG25、50、100μg/mL3個劑量組和陽性藥對照組（參一膠囊50μg/mL）。用0.1%的新潔爾滅溶液浸泡消毒后放于溫度37℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育。將種蛋鈍端向上，呈45o傾斜，每天翻動雞蛋3次，孵育7d后備用。2.4SCPG對CAM血管生成的作用參照文獻[4]并改進，于超凈工作臺中將種蛋開窗完畢，用微量移液器分別滴加10μL低、中、高劑量的SCPG溶液，50μg/mL參一膠囊溶液和生理鹽水于CAM上，添加完畢后用無菌透明膠封閉窗口，做好標記。每24h加藥1次，連續(xù)加藥3d。操作完畢后繼續(xù)將種蛋放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育，種蛋平放，不再翻蛋。檢測結(jié)束后，由觀察窗加入甲醇:丙酮=1:1的固定液固定15min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼及卵殼膜，眼科剪完整地剪取以加藥點為中心的CAM，迅速置于盛有生理鹽水的碟皿中，用彎頭吸管吹散舒展CAM，并將CAM轉(zhuǎn)移到大玻片上，平鋪舒展，于解剖顯微鏡（×10）下立即拍照，記錄血管生長形態(tài)。拍照完畢后立即計數(shù)加藥點周圍5mm內(nèi)的微血管數(shù)目。并按以下公式來計算血管生成抑制率。血管生成抑制率=[(模型組血管數(shù)-給藥組血管數(shù))/模型組血管數(shù)]×100%2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計本實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，比較組間差異性。3結(jié)果3.1SCPG對HUVEC細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，SCPG作用24h后，HUVEC細胞的增殖能力發(fā)生明顯改變。并且隨著濃度的增高，SCPG對HUVEC的增殖抑制作用強度更加明顯，并呈濃度依賴性關(guān)系，經(jīng)測定SCPG低、中、高3個劑量組對HUVEC細胞增殖的抑制率分別達到了6.67%，15.41%和31.85%，見表1、圖1。表1.SCPG對HUVEC細胞A值的影響（±s）Tab1EffectofSCPGontheabsorbanceofHUVEC組別濃度（μg/mL）A值空白--1.6461±0.0499SCPG251.5423±0.0773*501.3918±0.1775**1001.1505±0.2129***注：空白組比較，*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001Note:*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001，comparedwithblankgroup圖1.SCPG對HUVEC細胞抑制率的影響Fig1.EffectofSCPGontheinhibitionrateofHUVEC3.2SCPG對CAM血管生成數(shù)的影響表2.SCPG對CAM血管生成數(shù)的影響（±s）Tab2EffectofSCPGontheangiogenesisnumberofCAM組別濃度（μg/mL）雞胚數(shù)（個）血管計數(shù)(根)抑制率（%）空白--936.33±2.49--參一膠囊50821.14±2.59***41.02SCPG25933.42±2.77*7.9950831.42±3.62**13.49100826.85±3.67***26.08注：空白組比較，*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001Note:*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001，comparedwithblankgroup由表2可以看出，空白組加藥點周圍血管數(shù)目最多，說明模型建立成功。SCPG低、中、高3個劑量組的抑制率分別為7.99%、13.49%、26.08%，與空白組比較均有統(tǒng)計學差異。其中，SCPG低劑量組的抑制作用較弱，與空白組的差異性也最?。坏S著藥物劑量的增加，抑制作用有逐漸增強趨勢。SCPG高劑量組的抑制作用最大，僅次于陽性藥參一膠囊組。3.3SCPG對CAM血管生成形態(tài)學的影響通過光鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，自然狀態(tài)生長的CAM和模型組的CAM血管網(wǎng)絡(luò)呈葉脈樣，放射性生長，主血管粗壯，長勢旺盛，CAM血管生長發(fā)育狀態(tài)良好，說明模型建立成功；參一膠囊組，CAM血管細小而其網(wǎng)絡(luò)分支較少，且加藥點出現(xiàn)相對無血管區(qū)域，說明血管生長受到抑制；SCPG低、中、高劑量組CAM血管相對于模型組的CAM，血管呈變小和減少趨勢，網(wǎng)絡(luò)分支也相對減少，說明血管生長受到不同程度的抑制。此外，SCPG各劑量組隨著劑量的增加，CAM血管局部減少趨勢增大，無血管區(qū)域也逐漸增多，說明SCPG對CAM血管生成抑制作用隨劑量的增大而逐漸增強，呈劑量依賴性關(guān)系，結(jié)果見圖2。圖2.SCPG抑制CAM血管生成作用形態(tài)學觀察（×10）注：A、自然狀態(tài)生長CAM，B、模型組，C、參一膠囊組，D、SCPG低劑量組，E、SCPG中劑量組，F(xiàn)、SCPG高劑量組Fig2MorphologyofCAManti-angiogenicactivitiesaboutSCPGNote:A、naturalgrowthgroup，B、modelgroup，C、shenyicapsulesgroup，D、lowdosegroupofSCPG，E、middledosegroupofSCPG，F(xiàn)、highdosegroupofSCPG

4．討論血管生成是指已存在的毛細血管和毛細血管后靜脈通過分裂或出芽的方式發(fā)展形成新生血管。通常情況下，除了胚胎發(fā)育外較少發(fā)生；但在損傷治愈、炎癥等病理情況下也有血管生成，特別是實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管生成密切相關(guān)[5]。新生血管為腫瘤細胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)，原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤生長到0.2cm3時，如果沒有新生血管供應(yīng)營養(yǎng)，腫瘤將停止生長并逐漸死亡[6]。因此，抑制新生血管生成已成為抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的有效途徑之一，TAI的出現(xiàn)更加證實了這一點。TAI是指能破壞或者抑制腫瘤的新生血管生成、有效地阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的藥物總稱[7]。目前已有大量的TAI上市，如恩度、索坦等。近年來從中藥材中提取TAI的研究也相對較多，如已上市的參一膠囊等也具有良好的療效。但目前的TAI最大的缺點是價格昂貴，廣泛使用存在一定難度。尤其像參一膠囊其主要成分為人參皂苷Rg3，含量稀少資源匱乏。桔梗作為傳統(tǒng)的鎮(zhèn)咳祛痰中藥，藥用歷史悠久，價格低廉，且國內(nèi)資源十分豐富，全國大部分地區(qū)均有。若能將其開發(fā)為抗腫瘤或抗血管生成類藥物將有著廣闊的應(yīng)用前景。本實驗通過HUVEC和CAM模型考察了SCPG對HUVEC細胞增殖和CAM血管生成的影響。實驗結(jié)果表明SCPG在25～100μg/mL劑量范圍內(nèi)對HUVEC增殖有明顯的抑制作用。并隨著濃度的增大，抑制作用逐漸增強，呈劑量依賴性關(guān)系。同等劑量范圍內(nèi)SCPG對CAM血管生成也呈現(xiàn)良好的抑制作用，并隨著劑量的增大，損傷、抑制作用更加明顯。如此，則證明了SCPG對新生血管生成具有一定的抑制作用。這為桔梗中皂苷類成分抗腫瘤作用機理的探討提供了思路，也為桔梗中皂苷類成分和桔梗藥材的進一步開發(fā)應(yīng)用鋪墊了基礎(chǔ)。但SCPG抑制血管生成作用的研究還不夠深入，還有待于科研工作者的進一步探索。

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社會實踐報告系別：班級：學號：姓名：作為祖國未來的事業(yè)的繼承人，我們這些大學生應(yīng)該及早樹立自己的歷史責任感，提高自己的社會適應(yīng)能力。假期的社會實踐就是很好的鍛煉自己的機會。當下，掙錢早已不是打工的唯一目的，更多的人將其視為參加社會實踐、提高自身能力的機會。許多學校也積極鼓勵大學生多接觸社會、了解社會，一方面可以把學到的理論知識應(yīng)用到實踐中去，提高各方面的能力；另一方面可以積累工作經(jīng)驗對日后的就業(yè)大有裨益。進行社會實踐，最理想的就是找到與本專業(yè)對口單位進行實習，從而提高自己的實戰(zhàn)水平，同時可以將課本知識在實踐中得到運用，從而更好的指導(dǎo)自己今后的學習。但是作為一名尚未畢業(yè)的大學生，由于本身具備的專業(yè)知識還十分的有限，所以我選擇了打散工作為第一次社會實踐的方式。目的在于熟悉社會。就職業(yè)本身而言，并無高低貴賤之分，存在即為合理。通過短短幾天的打工經(jīng)歷可以讓長期處于校園的我們對社會有一種更直觀的認識。實踐過程：自從走進了大學，就業(yè)問題就似乎總是圍繞在我們的身邊，成了說不完的話題。在現(xiàn)今社會，招聘會上的大字報都總寫著“有經(jīng)驗者優(yōu)先”，可還在校園里面的我們這班學子社會經(jīng)驗又會擁有多少呢？為了拓展自身的知識面，擴大與社會的接觸面，增加個人在社會競爭中的經(jīng)驗，鍛煉和提高自己的能力，以便在以后畢業(yè)后能真正真正走入社會，能夠適應(yīng)國內(nèi)外的經(jīng)濟形勢的變化，并且能夠在生活和工作中很好地處理各方面的問題，我開始了我這個假期的社會實踐-走進天源休閑餐廳。實踐，就是把我們在學校所學的理論知識，運用到客觀實際中去，使自己所學的理論知識有用武之地。只學不實踐，那么所學的就等于零。理論應(yīng)該與實踐相結(jié)合。另一方面，實踐可為以后找工作打基礎(chǔ)。通過這段時間的實習，學到一些在學校里學不到的東西。因為環(huán)境的不同，接觸的人與事不同，從中所學的東西自然就不一樣了。要學會從實踐中學習，從學習中實踐。而且在中國的經(jīng)濟飛速發(fā)展，又加入了世貿(mào)，國內(nèi)外經(jīng)濟日趨變化，每天都不斷有新的東西涌現(xiàn)，在擁有了越來越多的機會的同時，也有了更多的挑戰(zhàn)，前天才剛學到的知識可能在今天就已經(jīng)被淘汰掉了，中國的經(jīng)濟越和外面接軌，對于人才的要求就會越來越高，我們不只要學好學校里所學到的知識，還要不斷從生活中，實踐中學其他知識，不斷地從各方面武裝自已，才能在競爭中突出自已，表現(xiàn)自已。在餐廳里,別人一眼就能把我人出是一名正在讀書的學生,我問他們?yōu)槭裁?他們總說從我的臉上就能看出來,也許沒有經(jīng)歷過社會的人都有我這種不知名遭遇吧!我并沒有因為我在他們面前沒有經(jīng)驗而退后,我相信我也能做的像他們一樣好.我的工作是在那做傳菜生,每天9點鐘-下午2點再從下午的4點-晚上8:30分上班,雖然時間長了點但,熱情而年輕的我并沒有絲毫的感到過累,我覺得這是一種激勵,明白了人生,感悟了生活,接觸了社會,了解了未來.在餐廳里雖然我是以傳菜為主,但我不時還要做一些工作以外的事情，有時要做一些清潔的工作，在學校里也許有老師分配說今天做些什么，明天做些什么，但在這里，不一定有人會告訴你這些，你必須自覺地去做，而且要盡自已的努力做到最好，一件工作的效率就會得到別人不同的評價。在學校，只有學習的氛圍，畢竟學校是學習的場所，每一個學生都在為取得更高的成績而努力。而這里是工作的場所，每個人都會為了獲得更多的報酬而努力，無論是學習還是工作，都存在著競爭，在競爭中就要不斷學習別人先進的地方，也要不斷學習別人怎樣做人，以提高自已的能力！記得老師曾經(jīng)說過大學是一個小社會，但我總覺得校園里總少不了那份純真，那份真誠，盡管是大學高校，學生還終歸保持著學生的身份。而走進企業(yè)，接觸各種各樣的客戶、同事、上司等等，關(guān)系復(fù)雜，但我得去面對我從未面對過的一切。記得在我校舉行的招聘會上所反映出來的其中一個問題是，學生的實際操作能力與在校理論學習有一定的差距。在這次實踐中，這一點我感受很深。在學校，理論的學習很多，而且是多方面的，幾乎是面面俱到；而在實際工作中，可能會遇到書本上沒學到的，又可能是書本上的知識一點都用不上的情況?；蛟S工作中運用到的只是很簡單的問題，只要套公式似的就能完成一項任務(wù)。有時候我會埋怨，實際操作這么簡單，但為什么書本上的知識讓人學得這么吃力呢？這是社會與學校脫軌了嗎？也許老師是正確的，雖然大學生生活不像踏入社會，但是總算是社會的一個部分，這是不可否認的事實。但是有時也要感謝老師孜孜不倦地教導(dǎo)，有些問題有了有課堂上地認真消化，有平時作業(yè)作補充，我比一部人具有更高的起點，有了更多的知識層面去應(yīng)付各種工作上的問題，作為一名大學生，應(yīng)該懂得與社會上各方面的人交往，處理社會上所發(fā)生的各方面的事情，這就意味著大學生要注意到社會實踐，社會實踐必不可少。畢竟，很快我就不再是一名大學生，而是社會中的一分子，要與社會交流，為社會做貢獻。只懂得紙上談兵是遠遠不及的，以后的人生旅途是漫長的，為了鍛煉自己成為一名合格的、對社會有用的人才.很多在學校讀書的人都說寧愿出去工作，不愿在校讀書；而已在社會的人都寧愿回校讀書。我們上學，學習先進的科學知識，為的都是將來走進社會，獻出自己的一份力量，我們應(yīng)該在今天努力掌握專業(yè)知識，明天才能更好地為社會服務(wù)。實踐心得：雖然這次的實踐只有短短的幾天，而且從事的是比較簡單的服務(wù)工作，但是通過與各種各樣的人接觸，還是讓我學會了很多道理。首先是明白了守時的重要性。工作和上學是兩種完全不同的概念，上學是不遲到很多時候是因為懼怕老師的責怪，而當你走上了工作崗位，這里更多的是由于自己內(nèi)心的一種責任。這種責任是我學會客服自己的惰性，準時走上自己的崗位。這對我以后的學